Т 55 (12)
ИЗВЕСТИЯ ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ
ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ
2012
УДК 544.77.022.823:546.62-31
В.В. Виноградов, Г.А. Дышина, А.В. Виноградов, А.В. Агафонов
БЫЧИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН, ЭНТРАПИРОВАННЫЙ В МАТРИЦУ ОКСИДА
АЛЮМИНИЯ: ЗОЛЬ-ГЕЛЬ СИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ТЕРМИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ∗
(Институт химии растворов им. Г.А. Крестова РАН)
Данная статья впервые описывает эффект термической стабилизации энтрапированных
биомолекул в керамическую матрицу, отличную от кремнезема. Данное исследование
посвящено изучению структуры золь-гель матрицы на основе оксида алюминия
в присутствии модельного белка – бычьего сывороточного альбумина (БСА). Зольгель
матрицы были получены с помощью гидролиза изопропоксида алюминия при различных
значениях pH для получения матриц с различными текстурными свойствами.
Для пептизации были использованы азотная кислота, уксусная кислота и ультразвуковая
(УЗ) обработка. Развитие структуры матрицы с энтрапированным белком исследовано
с помощью комплекса методов, включая рентгеноструктурный анализ, метод ИКспектроскопии,
метод динамического светорассеяния, метод атомно-силовой микроскопии
и метод низкотемпературной адсорбции/десорбции азота. В итоге, были синтезированы
образцы с различными текстурными характеристиками и размером частиц.
По результатам дифференциальной сканирующей калориметрии показано смещение
температуры денатурации свободного белка по сравнению с энтрапированным в матрицу
оксида алюминия на 26°С в сторону более высоких температур.
Виноградов
Владимир Валентинович –
к.х.н., младший научный сотрудник
лаборатории химии гибридных наноматериалов
и супрамолекулярных
систем ИХР РАН.
Область научных интересов: золь -
гель синтез, гетерогенный катализ,
биоматериалы
Тел.: +7(4932)20-33-31,
e-mail: vvv@isc-ras.ru
Виноградов
Александр Валентинович –
к.х.н., младший научный сотрудник
лаборатории химии гибридных наноматериалов
и супрамолекулярных
систем ИХР РАН, старший преподаватель
кафедры «Технология керамики
и наноматериалов» ИГХТУ.
Область научных интересов: зольгель
синтез, фотоактивные и магнитные
наноматериалы.
Тел.: +7(4932)33-62-64,
e-mail:vav@isc-ras.ru
бильность
∗ Обзорная статья
ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ 2012 том 55 вып. 12
3
Дышина
Галина Александровна –
к.х.н., младший научный сотрудник
лаборатории химии гибридных наноматериалов
и супрамолекулярных
систем ИХР РАН.
Область научных интересов: зольгель
синтез биоактивных препаратов,
микроэлектромеханические системы.
Тел.: +7(4932)33-62-64,
e-mail: gak@isc-ras.ru
Агафонов
Александр Викторович –
д.х.н., зав. лабораторией химии гибридных
наноматериалов и супрамолекулярных
систем ИХР РАН, профессор
кафедры «Технология керамики
и наноматериалов» ИГХТУ.
Область научных интересов: химия
функциональных наноматериалов.
Тел.: +7(4932)33-62-64,
e-mail: ava@isc-ras.ru
Ключевые слова: золь-гель, оксид алюминия, биомолекулы, энтрапирование, термическая ста
Стр.1
ВВЕДЕНИЕ
Начиная с 1990-х годов золь-гель метод
был успешно использован для капсулирования
различных объектов: от красителей [1] или масел
[2] до более сложных биомолекул, таких как ферменты
[3,4], бактерии [5] и клетки [6]. Капсулирование
происходит при непосредственном введении
биомолекул в золь в процессе образования
неорганического полимерного каркаса при температуре
окружающей среды. При этом образуется
гель с активной фазой, равномерно распределенной
по внутренней поверхности геля (или ксерогеля).
Физические характеристики (такие как
плотность, размер пор и наноструктура) таких оксигидроксидов,
полученных в процессе золь –
гель синтеза могут варьироваться за счет регулирования
кинетики протекания реакций гидролиза
и дальнейшей конденсации [7-9]. Возможность
тщательного контролирования микроструктуры
ксерогелей крайне важна при создании систем с
контролируемым высвобождением биообъектов в
процессе практического использования. Например,
при переходе от щелочного к кислотному
гидролизу структура геля SiO2 может измениться
от мезопористой к микропористой, при этом подвижность
закапсулированных биомолекул резко
снижается и скорость высвобождения уменьшается
[10]. Аналогичным образом влияют другие исходные
параметры (соотношение вода/алкоксид,
спирт/алкоксид, время старения, время и температура
сушки и т.д.), которые также могут быть использованы
для регулирования скорости высвобождения
из пористой структуры гелей.
Широкий спектр различных параметров
золь - гель процесса, которые могут быть использованы
для регулирования скорости высвобождения
лекарственных препаратов, привели к появлению
новых видов продукций, биосовместимых с
организмом, включающих в своем составе закапсулированные:
антибиотики [11], антикоагулянты
[12], анальгетики [13], гипотоники [14], белки
[15], гормоны [16], антиэстрогены [17], антипротивосудорожные
[18] и противоопухолевые средства
[19] и даже аденовирус [20].
Несмотря на то, что большинство исследований
связано с использованием силикатных прекурсоров,
существует огромное число других прекурсоров
на основе переходных металлов (Ti, V,
Zr) или металлов III группы периодической таблицы
(B и Al), которые также могут быть использованы
для эффективной иммобилизации биообъектов.
Данные несиликатные прекурсоры отличаются
более высокой реакционной способностью в
водной среде из-за низкой электроотрицательности
металла и его способности находиться в раз4
личных
координационных состояниях [21]. Например,
глюкозооксидаза была успешно закапсулирована
в псевдобемитовый гель [22]. Оксигидроксиды
алюминия были также применены для
иммобилизации полифенолоксидазы [23]. Но наиболее
распространенным является использование
гидроксоформ алюмооксидных систем в качестве
адъювантов.
Алюминиевые адъюванты используются в
практической вакцинации уже более полувека для
выработки защитного иммунитета у организма.
Миллиарды доз вакцин на основе гидроксоформ
алюминия вводились на протяжении многих лет, и
они в настоящее время являются наиболее широко
используемыми для вакцинации животных и человека.
Алюминиевые
адъюванты считаются
безопасными при использовании в соответствии с
действующими нормами вакцинации [24, 25]. В
отличие от традиционных вакцин, в которых антиген
адсорбируется на поверхности гидроксоформ
алюминия, в данной работе рассмотрены
подходы по получению вакцин нового поколения
– композитов, в которых белок закапсулирован в
матрицу геля оксигидроксида алюминия. Необходимо
рассмотреть аспекты золь-гель синтеза при
различных условиях приготовления и оценить
термическую стабильность белков в закапсулированном
состоянии. Бычий сывороточный альбумин
будет использован в качестве модельного
белка для капсулирования.
В данной работе золь-гель методом был
синтезирован оксигидроксид алюминия, полученный
при различных условиях с целью его применения
в качестве матрицы для иммобилизации
бычьего сывороточного альбумина (БСА) для
улучшения его термической стабильности. А также
предложены подходы, позволяющие регулировать
размер и структуру формирующихся композитов
для использования их в качестве потенциальных
вакцин.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. Изопропоксид алюминия
(Al(C3H7O)3), азотная кислота (HNO3), уксусная
кислота (CH3COOH) и бычий сывороточный альбумин
(БСА) были использованы фирмы Sigma
Aldrich.
Синтез псевдобемитовых золей. Псевдобемитовые
золи были получены, используя метод
Йолдаса, посредством пептизации осадка гидроксида
алюминия азотной кислотой (образец 1) и
уксусной кислотой (образец 2). Более подробно,
3.28 г Al(C3H7O)3 было добавлено в 50 мл дистиллированной
воды, что привело к образованию беХИМИЯ
И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ 2012 том 55 вып. 12
Стр.2
лого осадка. Осадок был пептизирован 0.2 (2 мл
уксусной кислоты) мл концентрированной азотной
(уксусной) кислоты при 90°C при интенсивном
перемешивании в течение 2 часов для получения
стабильного и прозрачного бемитового золя
и для испарения изопропанола, образующегося
при гидролизе. Конечные значения pH растворов
были 2.8 (4.8 в среде уксусной кислоты). В другом
случае (образец 3), для того чтобы избежать кислой
среды, белый осадок обрабатывался ультразвуком
(37 кГц, 0063 кВт) в течение 4 часов без
добавления кислоты (рН 7.3). Через 4 ч образовался
гель.
Синтез с энтрапированными молекулами
БСА. Полученные бемитовые золи были охлаждены
до 4°C. Далее 0.03 г бычьего сывороточного
альбумина было растворено при комнатной
температуре в среде бемитовых золей и оставлено
на 3 часа. Полученные растворы были высушены
при 20°C в течение недели для получения образцов
4,5,6, приготовленных с использованием азотной
кислоты, уксусной кислоты и при УЗ обработке
соответственно.
Характеристика методов. Удельная площадь
поверхности, объем пор и распределение
пор по размерам были определены методом адсорбции-десорбции
азота при 77 К (Quantachrome
Nova 1200). Площадь поверхности была рассчитана,
используя уравнение BET, объем пор и распределение
пор по размерам были определены
используя метод BJH. Перед анализом образцы
были дегазированы в течение 4 часов при комнатной
температуре. Распределение размеров гидродинамического
радиуса было измерено методом
динамического светорассеяния (DLS, Malvern,
Zeta-sizer nano ZS). ДСК кривые были получены с
использованием DSC 204 F1 Phoenix NETZSCH со
скоростью нагрева 10 K/мин. Кристаллическая
фаза и кристалличность образцов были измерены
методом рентгеновской дифракции (РФА) (Bruker
D8 Advance) с помощью Cu-Кα излучения (λ = 1,54
Å), образцы были сканированы по 2θ в диапазоне
4-60°С со скоростью 2 градуса в минуту. Твердые
образцы были охарактеризованы методом ИКспектроскопии
с помощью спектрометра «Avatar
360 FTTIR ESP» и с помощью атомно-силового
микроскопа (АСМ) SPM Solver P47H-PRO. Образцы
для сканирования наносились на стеклянную
подложку с идеально чистой поверхностью.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Измерения методом динамического светорассеяния.
Рис. 1 показывает средний гидродинамический
размер частиц гидрозоля оксида
алюминия и продуктов взаимодействия между
частицами гидрозоля оксида алюминия и бычьим
сывороточным альбумином. Высокое мольное соотношение
[H+/Al3+] и высокий заряд на поверхности
частиц приводят к предотвращению коагуляции
и осаждению агрегированных частиц оксида
алюминия в присутствии БСА за счет электростатического
отталкивания. Избыток кислоты может
сжимать двойной электрический слой таким
образом, что сила взаимодействия частиц на расстоянии
уменьшается во время столкновения, в
результате чего образуются агломераты.
Таким образом, мы выбрали оптимальные
концентрации азотной и уксусной кислоты, необходимой,
с одной стороны, для разделения частиц
на более мелкие во время пептизации и для предотвращения
коагуляции частиц оксида алюминия.
Образец 1 имеет средний гидродинамический
радиус 26.2 нм. В случае использования уксусной
кислоты средний гидродинамический радиус увеличивается
и соответствует 31.2 нм, что связано с
меньшим значением ионной силы раствора. Использование
физических методов пептизации может
приводить к образованию устойчивых золей и
гелей без введения дополнительных ионов. При
этом интенсивность и скорость их образования
зависит от частоты и мощности ультразвука. При
облучении осадка, полученного в результате гидролиза
изопропоксида алюминия, образуется золь
с достаточно широким распределением частиц по
размерам (рис. 1).
Согласно [26], необходимо отметить, что
для многих вакцин на основе белков лучший эффект
достигается в интервале значений рН между
изоэлектрической точкой белка антигена и точкой
нулевого заряда адъюванта оксида алюминия. В
этом интервале адъювант и антиген будут иметь
противоположные электрические заряды, способствующие
электростатическому притяжению и
адсорбции. В нашем случае наибольшее взаимодействие
достигается в интервале pH от 4,7 до 8,
поскольку именно в этом интервале молекулы
бычьего сывороточного альбумина и частицы золя
оксида алюминия заряжены разноименно. Использование
азотной кислоты в качестве пептизатора
способствует понижению значения pH до
уровня 2.8, что вызывает отталкивание частиц
между собой и, как следствие, взаимодействия
наночастиц оксида алюминия (НОА) и молекул
бычьего сывороточного альбумина (БСА) не происходит.
Данный факт подтверждается присутствием
нескольких пиков 16.3, 95, 553.2; 2400 нм на
кривой распределения частиц по размерам
(рис.1.). Использование уксусной кислоты и ультразвуковой
обработки создает значение pH в растворе
равное 4.8 и 7.3 соответственно, что соотХИМИЯ
И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ 2012 том 55 вып. 12
5
Стр.3