ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
9. Масалова О.В., Леснова Е.И., Шингарова Л.Н., Туницкая В.Л., Уланова
Т.И., Бурков А.Н. и др. Комбинированное применение нуклеотидных
и аминокислотных последовательностей белка NS3 вируса
гепатита С, гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего
фактора и блокатора регуляторных Т-клеток индуцирует
эффективный иммунный ответ против вируса гепатита С. Молекулярная
биология. 2012; 46 (3): 525–34.
10. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Атанадзе С.Н., Лакина Е.И.,
Семилетов Ю.А., Бурков А.Н. и др. Характеристика панели моноклональных
антител и эпитопное картирование белков вируса гепатита
С. Доклады РАН. 2002; 383 (4): 545–50.
11. Муковня А.В., Туницкая В.Л., Хандажинская А.Л., Голубева Н.А.,
Закирова Н.Ф., Иванов А.В. и др. Хеликаза/NTPаза вируса гепатита
С. Эффективная система экспрессии и новые ингибиторы. Биохимия.
2008; 73: 822–832.
12. Уланова Т.И., Пузырев В.Ф., Бурков А.Н., Обрядина А.П. Влияние
гетерогенности аминокислотной последовательности на иммунореактивность
комплекса антигенных эпитопов, локализованного в
пределах 1192-1456 аминокислот белка NS3 вируса гепатита С. Вопросы
вирусологии. 2006; 51 (1): 28–30.
14. Масалова О.В., Леснова Е.И., Грабовецкий В.В., Смирнова О.А.,
Уланова Т.И., Бурков А.Н. и др. ДНК-иммунизация плазмидой, содержащей
ген белка NS5A вируса гепатита C, индуцирует эффективный
клеточный иммунный ответ. Молекулярная биология. 2010;
44 (2): 275–83.
15. Масалова О.В., Кущ А.А. Моноклональные антитела к белкам вируса
гепатита С – инструмент для картирования антигенных детерминант,
диагностики гепатита С и изучения вирусного патогенеза. Российский
биотерапевтический журнал. 2003; 2 (3): 7–24.
Поступила 15.05.14
REFERENCES
1. Horner S.M. Activation and evasion of antiviral innate immunity by hepatitis
C virus. J. Mol. Biol. 2014; 426 (6): 1198–209.
2. Irshad M., Mankotia D.S., Irshad K. An insight into the diagnosis and
pathogenesis of hepatitis C virus infection. World J. Gastroenterol. 2013;
19 (44): 7896–909.
3. Pawlotsky J.M. Hepatitis C virus: standard-of-care treatment. Adv. Pharmacol.
2013; 67: 69-215.
4. Rupp D., Bartenschlager R. Targets for antiviral therapy of hepatitis C.
Semin. Liver Dis. 2014; 34 (1): 9-21.
5. Halliday J., Klenerman P., Barnes E. Vaccination for hepatitis C virus: closing
in on an evasive target. Expert Rev. Vaccines. 2011; 10 (5): 659–72.
6. Honegger J.R., Zhou Y., Walker C.M. Will there be a vaccine to prevent
HCV infection? Semin. Liver Dis. 2014; 34 (1): 79–88.
7. Masalova O.V., Lesnova E.I., Ivanov A.V., Pichugin A.V., Permyakova
K.Yu., Smirnova O.A. et al. Comparative analysis of the immune response
to DNA constructions encoding hepatitis C virus nonstructural
proteins. Voprosy virusologii. 2013; 58 (2): 21–8. (in Russian)
8. Moradpour D., Penin F., Rice C.M. Replication of hepatitis C virus. Nat.
Rev. Microbiol. 2007; 5: 453–63.
9. Masalova O.V., Lesnova E.I., Shingarova L.N., Tunitskaia V.L., Ulanova
T.I., Burkov A.N. et al. The combined application of nucleotide and
amino acid sequences of NS3 hepatitis C virus protein, DNA encoding
granulocyte macrophage colony-stimulating factor and inhibitor of regulatory
T cells induces effective immune response against hepatitis C virus.
Molecularnaya biology. 2012; 46 (3): 525–34. (in Russian)
10. Masalova O.V., Abdulmedzhidova A.G., Atanadze S.N., Lakina E.I.,
Semiletov Yu.A., Burkov A.N. et al. Characterization of a panel of monoclonal
antibodies and mapping the epitopes of hepatitis C virus proteins.
Doklady RAN. 2002; 383 (4): 545–50. (in Russian)
11. Mukovnya A.V., Tunitskaya V.L., Khandazhinskaya A.L., Golubeva NA,
Zakirova NF, Ivanov AV et al. Hepatitis C virus helicase/NTPase: an efficient
expression system and new inhibitors. Biokhimiya.. 2008; 73 (6):
660–8. (in Russian)
12. Ulanova T.I., Puzyrev V.F., Burkov A.N., Obyadina A.P. Impact of the
heterogenicity of amino acid sequence on the immunoreactivity of an
antigenic epitopic complex localized within amino acids 1192-1456 of
protein NS3 protein of hepatitis C virus. Voprosy virusologii. 2006; 51
(1): 28-30. (in Russian)
13. Ivanov A.V., Korovina A.N., Tunitskaya V.L., Kostyuk D.A., Rechinsky
V.O., Kukhanova M.K. et al. Development of the system ensuring a highlevel
expression of hepatitis C virus nonstructural NS5B and NS5A proteins.
Protein Expr. Purif. 2006; 48 (1): 14–23.
1
14. Masalova O.V., Lesnova E.I., Grabovetskiy V.V., Smirnova O.A., Ulanova
T.I., Burkov A.N. et al. DNA immunization with a plasmid carrying
the gene of hepatitis C virus protein 5A (NS5A) induces an effective cellular
immune response. Molecularnaya biologiya. 2010; 44 (2): 245–53.
(in Russian)
15. Masalova O. V., Kushch A.A. Monoclonal antibodies to hepatitis C virus
proteins as a tool for antigenic determinant mapping, hepatitis C diagnostics
and investigation of viral pathogenesis. Rossiyskiy bioterapevticheskiy
zhurnal. 2003; 2 (3): 7–24. (in Russian)
16. Thimme R., Neumann-Haefelin C., Boettler T., Blum H. Adaptive immune
responses to hepatitis C virus: from viral immunobiology to a vaccine.
J. Biol. Chem. 2008; 389 (5): 457–67.
17. Masalova O.V., Lesnova E.I., Pichugin A.V., Melnikova T.M., Grabovetsky
V.V., Petrakova N.V. et al. The successful immune response against hepatitis
C nonstructural protein 5A (NS5A) requires heterologous DNA/protein immunization.
Vaccine. 2010; 28 (8): 1987–96.
18. Alvarez-Lajonchere L., Shoukry N.H., Grá B., Amador-Cañizares Y.,
Helle F., Bédard N. et al. Immunogenicity of CIGB-230, a therapeutic
DNA vaccine preparation, in HCV-chronically infected individuals in a
Phase I clinical trial. J. Viral Hepatitis. 2009; 16 (3): 156–67.
19. Ghorbani M., Nass T., Azizi A., Soare C., Aucoin S., Giulivi A. et al.
Comparison of antibody- and cell-mediated immune responses after intramuscular
hepatitis C immunizations of BALB/c mice. Viral Immunol.
2005; 18 (4): 637–48.
20. Aricò E., Belardelli F. Interferon-α as antiviral and antitumor vaccine
adjuvants: mechanisms of action and response signature. J. Interferon
Cytokine Res. 2012; 32 (6): 235–47.
Received 15.05.14
ENHANCEMENT OF THE IMMUNE RESPONSE
BY CO-DELIVERY OF THE HEPATITIS C VIRUS
RECOMBINANT DNA AND PROTEINS OF
REPLICATIVE COMPLEX
Masalova O. V. 1
, Lesnova E. I. 1
Tunitskaya V. L.2
, Permyakova K. Yu. 1
, KushchА. А.1
, Ivanov A. V. 2
,
Ivanovsky Institute of Virology, Ministry of Health of the Russian
Federation, Moscow, Russia; 2
Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
Engelhardt Institute of Molecular
The plasmids encoding amino acid sequences corresponding to the
hepatitis C virus (HCV) are regarded as promising candidates for the
anti-HCV vaccines. However, optimal composition of these vaccines
was not determined. The goal of this work was to evaluate the immune
response after immunization of mice with the DNA construct pcNS3NS5B
encoding proteins, which constitute viral replicative complex
combined with the recombinant nonstructural proteins NS3 and NS5B
using various adjuvants. DBA mice were immunized with the DNA
construct and/or the recombinant proteins three times. The antibody
response was evaluated using ELISA. Cell immunity was estimated
using lymphocyte proliferation test in vitro and by production and
secretion of IFN-γ and IL-2 measured in ELISpot and ELISA. It was
found that the pcNS3-NS5B plasmid induced predominantly T cell
response, whereas the recombinant NS3 and NS5B proteins stimulated
a potent humoral immune response. It allowed us to demonstrate for
the first time a statistically significant stimulation of both humoral
and cell immunity after immunization with the pcNS3-NS5B in
combination with the NS3 and NS5B HCV proteins. It was noteworthy
that the animals developed the immune response not only to NS3 and
NS5B proteins, but also to other antigens encoded by pcNS3-NS5B
plasmid (NS4, NS5A). The most pronounced immune response was
observed in the mice subjected to a triple immunization with pcNS3NS5B
plasmid in combination with a gene adjuvant pcGM-CSF and
recombinant proteins (NS3 and NS5B), which were injected together
with IFN-α. The adjuvant activity of IFN-α, which was demonstrated
in a model of the HCV gene and proteins, can be prerequisite for
including it in a candidate vaccine.
Key words: hepatitis C virus, nonstructural proteins, DNA
immunization, recombinant proteins, immune response, adjuvants,
IFN-α; vaccine.
Стр.2
Институт молекулярной генетики РАН
1·2015
Том 33
Квартальный
научно-теоретический журнал
Основан в январе 1983 г.
РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ:
Главный редактор С. В. КОСТРОВ
Зам. главного редактора Ю. М. РОМАНОВА
Ответственный секретарь Т. С. ИЛЬИНА
В. И. АГОЛ, А. Д. АЛЬТШТЕЙН, А. П. АНИСИМОВ, В. А. ГВОЗДЕВ,
В. Н. ГЕРШАНОВИЧ, А.Л. ГИНЦБУРГ, В. В. ДЕМКИН, Е. Д. КУЗНЕЦОВА
(научный редактор), С. А. ЛИМБОРСКАЯ, С. А. ЛУКЬЯНОВ, Н. Ф. МЯСОЕДОВ,
С. В. НЕТЕСОВ, Е. Д. СВЕРДЛОВ, Г. Б. СМИРНОВ, Н. И. СМИРНОВА,
В. З. ТАРАНТУЛ
РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ:
А. М. БОРОНИН (Пущино-на-Оке), В. И. ВОТЯКОВ (Минск),
А. А. ПРОЗОРОВ (Москва), Ю. К. ФОМИЧЕВ (Минск),
С. В. ШЕСТАКОВ (Москва)
Журнал утвержден в Перечне ведущих научных журналов и изданий, выпускаемых в Российской
Федерации, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций
на соискание ученой степени доктора наук (Бюллетень ВАК)
Журнал полностью переводится на английский язык в США издательством ALLERTON PRESS, INC.
МОСКВА «ИЗДАТЕЛЬСТВО "МЕДИЦИНА"»
Стр.3
СОДЕРжАНИЕ
ОбзОР
Ильина Т. С. Нитчатые бактериофаги и их роль в вирулентности
и эволюции патогенных бактерий . . . . . . . . . . . . . . . . .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Холодий Г. Я., Тарантул В. З. Дифференциальная активность
сайтов инициации репликации ДНК, расположенных в хромосомной
полосе 9p22 человека ......................
Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Краснов Я.М. MLvA-типирование
клинических штаммов Vibrio cholerae, изолированных
в разные периоды текущей пандемии холеры . . . . . . .
Платонов М.Е., Евсеева В.В., Ефременко Д.В., Афанасьев
М.В., Вержуцкий Д.Б., Кузнецова И.В., Шестопалов
М.Ю., Дентовская С.В., Куличенко А.Н., Балахонов С.В.,
Анисимов А.П. Внутривидовая принадлежность рамнозопозитивных
штаммов Yersinia pestis из природных очагов
чумы Монголии ....................................
Мануйлов В.А., Осипова Л.П., Нетесова И.Г., Чуб Е.В., Безуглова
Л.В., Norder H., Magnius L.O., Нетёсов С.В. Распространенность
различных генотипов и субтипов HBsантигена
вируса гепатита В в группах коренного населения
Сибири ...........................................
Масалова О.В., Леснова Е.И., Пермякова К.Ю., Иванов А.В.,
Туницкая В.Л., Кущ А.А. Усиление иммунного ответа при
сочетанном введении рекомбинантных ДНК и белков репликативного
комплекса вируса гепатита С. . . . . . . . . . . . .
11
15
3
CONTENTS
REVIEW
Ilyina T. S. The Filamentous Bacteriophages and Their Role in
the virulence and Evolution of Pathogenic Bacteria
ExpErimEntal Works
Kholodii G. Ya. and Tarantul V. Z. Differential Activity of the
DNA Replication and Initiation Sites Attributed to the Human
Chromosome 9p22
Smirnova N. I., Kul’shan’ T. A., and Krasnov Ya. M. MLvATyping
of Clinical vibrio cholerae Strains Isolated during
Different Periods of the Current Cholera Pandemic
23
Platonov M. E., Evseeva V. V., Efremenko D. V., Afanas’ev M.
V., Verzhutski D. B., Kuznetsova I. V., Shestopalov M. Yu.,
Dentovskaya S. V., Kulichenko A. N., Balakhonov S. V.,
and Anisimov A. P. Intraspecies Belonging of the Rhamnose-fermentation-positive
Yersinia Pestis Isolates from
the Mongolian Natural Plague Foci
28
36
Manuilov V. A., Osipova L. P., Netesova I. G., Chub E. V., Bezuglova
L. V., Norder H., Magnius L. O., and Netesov S. V.
Prevalence of HBsAg Subtypes and Genotypes in Native
Population Groups of Siberia
Masalova O. V., Lesnova E. I., Permyakova K. Yu., Ivanov
A. V., Tunitskaya V. L., and Kushch А. А. Enhancement
of the Immune Response by Co-delivery of the Hepatitis
C virus Recombinant DNA and Proteins of Replicative
Complex
Индекс 71452
для индивидуальных подписчиков
Индекс 72152
для предприятий и организаций
ISSN 0208-0613. Молекул. генетика, микробиология и вирусология, 2015. № 1. 1–40.
Почтовый адрес редакции:
Москва, 109029
115088, ул. Новоостаповская, д. 5, стр. 14
ОАО «Издательство "Медицина"»
Редакция журнала "Молекулярная генетика, микробиология и вирусология"
Тел. редакции: 8 495 678-63-95
e-mail: molgenetika@yandex.ru
Зав. редакцией И. Х. Измайлова
ОТДЕЛ РЕКЛАМЫ
Тел./факс 8-495-678-64-84
E-mail: oao-meditsina@mail.ru
Ответственность
за достоверность информации,
содержащейся в рекламных
материалах, несут
рекламодатели.
Художественный редактор
А. В. Минаичев
Корректор Т. Д. Малышева
Переводчик С. К. Чаморовский
Все пpава защищены. Ни одна часть этого
издания не может быть занесена в память
компьютеpа либо воспpоизведена любым
способом без пpедваpительного письменного
pазpешения издателя.
Сдано в набор 21.10.14
Подписано в печать 12.12.14
Формат 60 Ч 88⅛
Печать офсетная. Печ. л. 5,00
Усл.-печ. л. 4,90. Уч.-изд. л. 5,50
Заказ 568
ЛР №010215 от 29.04.97 г.
www.medlit.ru
Отпечатано в типографии ООО "Подольская
Периодика",
142110, г. Подольск, ул. Кирова, 15
© ОАО «Издательство "Медицина"», 2015
2
Стр.4
ОБЗОР
© ИЛЬИНА Т.С., 2015
УДК 578.81:579.254.2
Ильина Т. С.
НИТЧАТЫЕ бАКТЕРИОФАГИ И ИХ РОЛЬ В ВИРУЛЕНТНОСТИ И ЭВОЛЮЦИИ
ПАТОГЕННЫХ бАКТЕРИЙ
ФГБУ « НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
Москва
Нитчатые бактериофаги рода Inovirus семейства Inoviridae инфицируют
множество грамотрицательных и некоторые грамположительные
бактерии. В обзоре обсуждаются современные
данные о роли нитчатых бактериофагов в вирулентности и эволюции
таких известных патогенных бактерий, как V. cholerae,
Yersinia pestis, Neisseria meningitides, Escherichia coli O18: K1:
H7, Pseudomonas aruginosa, и ряда патогенов сельскохозяйственных
растений.
Ключевые слова: нитчатые бактериофаги, патогенные
бактерии, вирулентность, эволюция бактерий.
В последние два десятилетия появилось множество
работ, посвященных обнаружению, выделению
и изучению нитчатых фагов, принадлежащих к роду
Inovirus семейства Inoviridae. Нитчатые фаги, широко
распространенные среди бактерий, инфицируют
широкий круг грамотрицательных бактерий разных
родов – Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Xanthomonas,
Vibrio, Thermus, Neisseria и др. [1], а также
некоторые грамположительные бактерии [2, 3].
Многие из них являются вирулентными и способны
лишь размножаться в клетках бактерий. Однако в последние
годы описан целый ряд умеренных нитчатых
фагов, способных внедрять свой геном в хромосому
хозяина и существовать в ней в виде профага (см. таблицу).
К
настоящему времени накоплено достаточно данных,
доказывающих, что несмотря на малый размер,
нитчатые фаги играют важную роль в изменчивости
и эволюции бактериальных хозяев [4–6]. Описано
множество аспектов взаимодействия бактерий с
нитчатыми фагами. Многие из них участвуют в подавлении
роста чувствительных к фагам бактерий,
производя отбор резистентных клеток, влияют на
улучшение приспособляемости бактерий к условиям
окружающей среды. Группа умеренных фагов вызывает
образование мутаций и геномных перестроек в
бактериальных геномах, влияет на образование биопленок
бактериями-хозяевами. Но наибольший интерес
представляют нитчатые фаги, способные влиять
на вирулентность бактерий. Благодаря взаимодействиям
самих фагов с бактериальным хозяином и их
способности осуществлять горизонтальный перенос
генов появляются новые патогенные бактерии (человека,
животных или растений), наблюдаются изменения
в существующих свойствах патогенных бактерий
или приобретаются новые свойства, создающие им
преимущество в отношении ранее существовавших
штаммов. Детально изучены на сегодня лишь немногие
фаги с такими свойствами, в основном связанные
с наиболее опасными и широко распространенными
патогенными бактериями.
3
Механизмы, ответственные за влияние фагов на
хозяина, могут быть разными, обусловленными либо
самим фактом интеграции генома фага в бактериальную
хромосому (лизогенизацией, способностью вызывать
лизогенные конверсии), либо горизонтальным
переносом фагом случайных чужеродных генов при
участии разных механизмов – трансдукции, транспозиции,
репликации по типу «катящегося кольца» [7].
Вирионы нитчатых фагов представляют собой
длинные тонкие спирально закрученные нити, внутри
которых заключена циркулярно замкнутая однонитевая
ДНК (ssDNA). Большинство сведений о структурной
организации фаговых геномов получено при изучении
фагов Ff E.coli и pf1 P. aeruginosa. Они имеют модулярную
структуру, при которой функционально родственные
гены сгруппированы вместе. Всегда присутствуют
3 функциональных модуля: модуль репликации, структурный
модуль и модуль сборки и секреции. Модуль
репликации содержит гены, кодирующие репликацию
по типу «катящегося кольца», и белки, ответственные
за связывание с однонитевой ДНК (gII, gv и gX, показано
на модели фага Ff E. coli) [7]. Структурный модуль
содержит гены главного (gvIII) и малых оболочечных
белков (gIII, gvI, gvII и gIX) и ген gIII, кодирующий
адсорбционный белок рIII. Модуль сборки и секреции
содержит гены морфогенеза и выхода фаговых частиц
(gI и gIv). Нитевидная структура вириона образована
тысячами спирально расположенных копий рvIII, небольшого
белка из 50 аминокислот. Концы нитей замкнуты
двумя различными парами белков – pvII–pIX и
pIII–pvI [8].
Нитчатые фаги, как и другие известные фаги, способны
существовать в клетках бактерий как вирулентные
либо как умеренные фаги, способные интегрировать
в хромосомы и сохраняться в них в виде профагов.
Внехромосомная репликация вирулентных вирусов
происходит практически неконтролируемо, поскольку
геномы нитчатых фагов не кодируют регуляторных
белков. Она осуществляется посредством репликации
по типу «катящегося кольца». Репродукция вирусов в
клетках хозяина не сопровождается гибелью клеток,
сборка зрелых частиц фагов происходит на поверхности
клеток, где они накапливаются и высвобождаются
способом, сходным с «выдавливанием». Экспрессия
генов и репликация интегрированных в хромосому
фагов строго контролируются регуляторами транскрипции,
которые подавляют транскрипцию репликационного
белка и белков вириона [8].
При лизогенизации бактерий используются различные
стратегии интеграции фаговых геномов в
Стр.5