2015, том 17 [5]
УДК: 582.711.71:581.47:547.973-024.17]:543.422.3
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ АНТОЦИАНОВ
В ПЛОДАХ АРОНИИ ЧЕРНОПЛОДНОЙ
В.Ю. Андреева, Н.В. Исайкина
ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России
Московский тракт, 2/7, Томск, Россия, 634050
эл. почта: vilival@yandex.ru
Плоды аронии черноплодной (рябины черноплодной) являются официнальным лекарственным сырьем. Свежие
плоды, сок аронии и таблетки оказывают адаптогенное, спазмолитическое, гипотензивное, диуретическое, желчегонное,
антиатеросклеротическое, С- и Р-витаминное действие. Для стандартизации сырья нами ранее был предложен
метод количественного определения суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной сухих методом прямой
спектрофотометрии в видимой области при длине волны 544 ± 2 нм в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид. В соответствии
с нормативными документами, регламентирующими процессы валидации новых аналитических методов,
для аттестации методики количественного определения суммы антоцианов необходимо было провести определение
следующих параметров: прецизионность (повторяемость) и воспроизводимость (лабораторная и межлабораторная),
правильность и линейность. Статистическая обработка полученных результатов в условиях повторяемости, показала,
что они достоверны при доверительной вероятности 95%, вычисленные значения величины относительного
стандартного отклонения (RSD) — 0,005% и относительного доверительного интервала среднего значения — 0,52%
не превышают критериев приемлемости — 5%, Воспроизводимость методики также является удовлетворительной,
так как меры прецизионности для данного метода измерений не превышают критериев приемлемости как для
внутрилабораторной прецизионности 1,50% < 10%, так и для межлабораторной прецизионности 8,06% < 15%.
В ходе определения линейности установлено, что график зависимости имеет линейный характер в области концентрации
суммы антоцианов. Коэффициент корреляции близок к единице –0,978, что свидетельствует о сильной
линейной зависимости значения оптической плотности от содержания действующих веществ. Правильность
методики устанавливали на идентичных образцах плодов аронии черноплодной с добавлением известного количества
стандартного образца цианидин-3-О-глюкозида. В разработанной методике процент восстановления находился
в пределах от 98,20% до 102,63%, его средняя величина составила 100,33%, что находится в пределах 100 ± 5%.
Таким образом, валидация методики количественного определения суммы антоцианов в экстракте плодов аронии
черноплодной по следующим характеристикам: прецизионность (повторяемость) и воспроизводимость (лабораторная
и межлабораторная), правильность и линейность показала, что данная методика является высокочувствительной,
правильной и воспроизводимой и может быть использована для стандартизации сырья.
Ключевые слова: валидация, арония черноплодная, антоцианы, повторяемость, воспроизводимость, линейность,
правильность.
Плоды аронии черноплодной (рябины черноплодной)
являются официнальным лекарственным
сырьем. Таблетки «Арония+С», свежие плоды
и сок аронии, оказывающие адаптогенное, спазмолитическое,
гипотензивное, диуретическое, желчегонное,
антиатеросклеротическое, С- и Р-витаминное
действие, назначают для профилактики
Р-витаминной недостаточности, лечения гипертензии
I и II стадий и других заболеваний, сопровождающихся
повышением артериального давле~
1 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий
и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518
Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта
по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Стр.1
2015, том 17 [5]
ния. Широкий спектр фармакологических свойств
аронии черноплодной обусловлен содержанием
богатого комплекса биологически активных веществ
(БАВ). Для стандартизации плодов аронии
черноплодной высушенных нами предложена
ранее методика количественного определения
суммы антоцианов методом прямой спектрофотометрии
в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид [1].
Для того чтобы аналитические методики гарантировали
достоверные и точные результаты анализа,
предусмотрена процедура их валидации (аттестации)
[2; 3]. В связи с этим, целью настоящего
исследования была валидационная оценка методики
спектрофотометрического определения количественного
содержания суммы антоцианов
в плодах аронии черноплодной сухих.
Материалы и методы. Объектами исследования
служили образцы плодов аронии черноплодной,
высушенные до воздушно-сухого состояния.
Количественное определение антоцианов проводили
методом прямого спектрофотометрического
определения при длине волны 544 нм в пересчете
на цианидин-3-О-глюкозид в соответствии
с ранее разработанной методикой [1]. При этом
принятое опорное значение содержания антоцианов
составило 10,859 ± 0,056%.
Валидацию методики проводили методами математической
статистики по следующим показателям:
прецизионность (повторяемость), воспроизводимость
(лабораторная и межлабораторная), правильность
и линейность [2; 3]. Статистическую
обработку результатов выполняли с помощью пакета
прикладных программ «Microsoft Excel 2007».
Результаты исследования. Повторяемость методики
определяли в условиях, при которых шесть
независимых результатов измерений получали
одним методом, в одной лаборатории, одним лаборантом-исследователем,
с использованием одного
спектрофотометра, в пределах короткого промежутка
времени. Статистическая обработка полученных
результатов, показала, что они достоверны
при доверительной вероятности 95%, вычисленные
значения величины относительного стандартного
отклонения (RSD) — 0,005% и относительного
доверительного интервала среднего значения —
0,52% не превышают критериев приемлемости —
5%, что свидетельствует о прецизионности методики
в условиях повторяемости (табл. 1).
Таблица 1
№ опыта
Обьем аликвоты
Оптическая плотность, D
Содержание антоцианов
в пересчете на цианидин-3-Огликозид,
%
Хср
10,8599
S2
0,0029
S
0,0540
Результаты оценки повторяемости методики
1
1,00
0,414
10,794
1,00
0,414
10,794
0,419
10,925
Метрологические характеристики
P (%)
95
Sх
0,0220
Sr
0,0049
Воспроизводимость методики определяли
на идентичных образцах сырья совместным оценочным
экспериментом в двух различных лабораториях
СибГМУ на различных приборах, разными
2 345 6
1,00
1,00
0,417
10,872
1,00
0,417
10,872
1.00
0,418
10,890
t (P, f)
2,57
∆хср
0,0567
ε, %
0,5223
лаборантами-исследователями по 3 испытания образца
на трех разных уровнях концентраций в интервале
80—120% от принятого опорного значения
(табл. 2). Статистическое тестирование выбросов
~ 2 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий
и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518
Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта
по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Стр.2
2015, том 17 [5]
проводили с использованием критерия Кохрена,
дисперсии и стандартного отклонения для каждого
уровня и рассчитывали по ГОСТ Р ИСО [3]. При
рассмотрении данных, не обнаружив, какой либо
зависимости, в качестве показателей прецизионности,
нами были выбраны средние значения стандартных
отклонений. Данные значения стандартных
отклонений могут быть применены в диапазоне
содержания антоцианов от 0,05 до 0,22
по массе. Меры прецизионности для данного метода
измерений не превышают критериев приемлемости
как для внутрилабораторной прецизионности
1,50% < 10%, так и для межлабораторной
прецизионности 8,06% < 15%, что
указывает на удовлетворительную воспроизводимость
методики.
Таблица 2
Результаты оценки воспроизводимости методики
Лаборатория № 1
Уровни
Объем аликвоты раствора А, мл
Оптическая плотность D1
Содержание антоцианов, %
Оптическая плотность D2
Содержание антоцианов, %
Оптическая плотность D3
Содержание антоцианов, %
Среднее содержание
антоцианов, %, Хср
№ лаборатории
Хср
1
6,69
1 10,84
1 16,23
2 7,02
2 11,41
2 17,37
S2
0,0043
0,0056
0,0301
0,5006
0,0051
0,0117
1
0,75
0,257
6,70
0,259
6,75
0,254
6,62
6,69
1,00
10,79
10,79
10,92
0,75
0,414
0,414
0,419
10,83
Sх
Sr
0,615
16,04
16,27
16,37
0,624
0,628
16,22
Метрологические характеристики
S
0,0656 0,0378 0,0098
0,0301 0,1002 0,0069
0,1736 0,1002 0,0106
0,7075 0,4048 0,1007
0,0398 0,0225 0,0034
0,1085 0,0626 0,0062
Линейность аналитической методики определяли
на пяти уровнях концентрации от принятого
опорного значения расчетной величины (10,86%).
Образцы готовили путем изменения аликвоты
(табл. 3) В ходе определения линейности установлено,
что график зависимости имеет линейный характер
в области концентрации суммы антоцианов
и описывается уравнением: y = 3,7422x + 1,0463
Коэффициент корреляции близок к единице
–0,978, что свидетельствует о сильной линейной
Р,%
95
95
95
95
95
95
0,238
6,20
0,285
7,43
0,285
7,43
7,02
t (P, f)*
4,3
4,3
4,3
4,3
4,3
4,3
Лаборатория № 2
23 12
1,25
3
1,00
0,439
11,45
11,44
11,36
0,438
0,436
11,41
∆х
0,1629
0,1116
2,6561
1,7565
0,0590
0,2693
1,25
0,663
17,30
17,31
17,49
0,664
0,671
17,37
ε, %
2,43
1,03
0,01
2,50
0,52
1,55
зависимости значения оптической плотности от содержания
действующих веществ. График зависимости
представлен на рисунке.
Правильность методики устанавливали на идентичных
образцах плодов аронии черноплодной
с добавлением известного количества стандартного
образца (СО) цианидин-3-О-глюкозида по 3 испытания
образца на трех уровнях концентраций
(табл. 4).
~ 3 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий
и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518
Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта
по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Стр.3