№ 4 МЕТОДЫ УДК 577.214 РАЗРАБОТКА ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫХ МОНОНУКЛЕОСОМ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСКРИПЦИИ МЕТОДОМ МИКРОСКОПИИ ОДИНОЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ К.С. <...> Феофанов1,3 (1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; 2 Программа эпигенетики рака, Центр исследований рака Фокс Чейз, Филадельфия, США (Cancer Epigenetics Program, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USA); 3 кафедра биоинженерии; e-mail: avfeofanov@yandex.ru) Флуоресцентная микроскопия одиночных молекул и комплексов становится все более востребованным методом изучения нуклеосом и функционально важных процессов с их участием. <...> В данной работе на основе флуоресцентно-меченой матрицы ДНК разработаны строго позиционированные мононуклеосомы, которые являются новым инструментом для исследования структурных перестроек в хроматине в процессе транскрипции РНК-полимеразой (РНКП). <...> В нетранскрибируемую цепь ДНК были введены два флуорофора — Cy3 (донор) и Cy5 (акцептор), которые после укладки ДНК на гистоновом октамере оказываются в средней части нуклеосомы на соседних участках ДНК на расстоянии менее 60 Е и взаимодействуют по механизму Фёрстеровского резонансного переноса энергии (Fцrster resonance energy transfer, FRET). <...> Изменение структуры нуклеосомы регистрировали по изменению эффективности FRET при изучении одиночных комплексов нуклеосом с РНКП методом флуоресцентной микроскопии. <...> Показано, что введение меток не повлияло на способность РНКП транскрибировать нуклеосомы. <...> Получены и охарактеризованы открытый комплекс с РНКП, а также элонгационные комплексы, остановленные в положениях –39 и –5 до границы нуклеосомы. <...> Показано, что после завершения транскрипции более 80% нуклеосом сохраняют свою структуру, восстанавливая исходную укладку ДНК на гистоновом октамере. <...> Разработанная экспериментальная система открывает новые возможности изучения структуры нуклеосом и модулирующего воздействия на них различных белковых шаперонов и ремоделирующих хроматин <...>