МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
секретируемых и трансмембранных белков Sec 61транслоконов,
солюбилизированных в дигитонине, показало,
что мембранный белок находится в комплексе с
прилежащим участком бислоя мембраны, который, как
полагают, кэпирован по гидрофобному краю дигитонином
[30]. Возможно, что аналогичным образом происходит
солюбилизация SMS1 сапонином.
Таким образом, метод сапониновой экстракции может
быть использован в исследованиях экспрессии SMS1 в
тканях человека, и, возможно, как метод получения экстракта
ткани для определения cфингомиелинсинтазной
энзиматической активности.
Работа выполнена при частичной поддержке Российским
фондом фундаментальных исследований (14-0400487),
Программой Российской академии наук “Молекулярная
и клеточная биология” и Программой поддержки
ведущих научных школ.
Сведения об авторах:
Институт молекулярной генетики РАН
Сударкина Ольга Юрьевна – канд. биол. наук, научн.
сотр. отдела молекулярных основ генетики человека;
e-mail: sudarolg@img.ras.ru
Дергунова Людмила Васильевна – канд. биол. наук,
ст. науч. сотр. отдела молекулярных основ генетики
человека, e-mail: lvdergunova@mail.ru
REFERENCES/ЛИТе РАТуРА
1. Tafesse F.G., Ternes P., Holthuis J.C. The multigenic sphingomyelin
synthase family. J. Biol. Chem. 2006; 281(40): 29421–5.
3. Huitema K., van den Dikkenberg J., Brouwers J.F., Holthuis J.C.
Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO
J. 2004; 23(1): 33–44.
5. Holthuis J.C., Luberto C. Tales and mysteries of the enigmatic sphingomyelin
synthase family. Adv. Exp. Med. Biol. 2010; 688: 72–85.
6. Holthuis J.C., Pomorski T., Raggers R.J., Sprong H., Van Meer G.
The organizing potential of sphingolipids in intracellular membrane
transport. Physiol. Rev. 2001; 81(4): 1689–723.
8. Hsiao J.H., Fu Y., Hill A.F., Halliday G.M., Kim W.S. Elevation in
sphingomyelin synthase activity is associated with increases in amyloid-beta
peptide generation. PLoS One. 2013; 8(8): e74016.
2. Ullman M.D., Radin N.S. The enzymatic formation of sphingomyelin
from ceramide and lecithin in mouse liver. J. Biol. Chem. 1974;
249(5): 1506–12.
4. Yamaoka S., Miyaji M., Kitano T., Umehara H., Okazaki T. Expression
cloning of a human cDNA restoring sphingomyelin synthesis
and cell growth in sphingomyelin synthase-defective lymphoid cells.
J. Biol. Chem. 2004; 279(18): 18688–93.
16. Rozhkova A.V., Dmitrieva V.G., Zhapparova O.N., Sudarkina O.Y.,
Nadezhdina E.S., Limborska S.A. et al. Human sphingomyelin synthase
1 gene (SMS1): organization, multiple mRNA splice variants
and expression in adult tissues. Gene. 2011; 481(2): 65–75.
15. Vladychenskaya I.P., Dergunova L.V., Dmitrieva V.G., Limborska
S.A. Human gene MOB: structure specification and aspects of transcriptional
activity. Gene. 2004; 338: 257–65.
17. Dergunova L., Rozhkova A., Sudarkina O., Limborska S. The use of
alternative polyadenylation in the tissue-specific regulation of human
SMS1 gene expression. Mol. Biol. Rep. 2013; 40: 6685–90.
18. Simpson R.J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring
Harb. Protoc. 2010; 2010(7):cpdb.prot5455.
21. Weissman A.M. Solubilization of lymphocytes. Curr. Protoc. Immunol.
2003; Chap. 8: Unit 8.1A.
20. Gallagher S.R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins.
Curr. Protoc. Mol. Biol. 2012; Chapter 10: Unit 10.2A.
25. Wassler M., Jonasson I., Persson R., Fries E. Differential permeabilization
of membranes by saponin treatment of isolated rat hepatocytes.
Release of secretory proteins. Biochem. J. 1987; 247(2):
407-15.
26. Tate C.G. Practical considerations of membrane protein instability
during purification and crystallisation. Meth. Mol. Biol. 2010; 601:
187-203.
27. Wittig I., Braun H.P., Schägger H. Blue native PAGE. Nat. Protoc.
2006; 1(1): 418–28.
28. Koiv A., Rinken A., Järv J. Fluidity of detergent micelles plays an
important role in muscarinic receptor solubilization. J. Biosci. 1990;
15(3): 149–52.
29. Zweig A., Siegel M.I., Egan R.W., Clark M.A., Shorr R.G., West
R.E. Jr. Characterization of a digitonin-solubilized bovine brain H3
histamine receptor coupled to a guanine nucleotide-binding protein.
J. Neurochem. 1992; 59(5): 1661–6.
30. Ménétret J.F., Hegde R.S., Aguiar M., Gygi S.P., Park E., Rapoport
T.A. et al. Single copies of Sec61 and TRAP associate with a nontranslating
mammalian ribosome. Structure. 2008; 16(7): 1126–37.
Поступила 31.07.14
Received 31.07.14
7. Taniguchi M., Okazaki T. The role of sphingomyelin and sphingomyelin
synthases in cell death, proliferation and migration-from
cell and animal models to human disorders. Biochim. Biophys. Acta.
2014; 1841(5): 692–703.
10. Ding T., Li Z., Hailemariam T., Mukherjee S., Maxfield F.R., Wu
M.P. et al. SMS overexpression and knockdown: impact on cellular
sphingomyelin and diacylglycerol metabolism, and cell apoptosis. J.
Lipid Res. 2008; 49(2): 376–85.
11. Separovic D., Semaan L., Tarca A.L., Awad Maitah M.Y., Hanada K.,
Bielawski J. et al. Suppression of sphingomyelin synthase 1 by small
interference RNA is associated with enhanced ceramide production
and apoptosis after photodamage. Exp. Cell Res. 2008; 314(8):
1860–8.
12. Guillén N., Navarro M.A., Surra J.C., Arnal C., Fernández-Juan M.,
Cebrián-Pérez J.A. et al. Cloning, characterization, expression and
comparative analysis of pig Golgi membrane sphingomyelin synthase
1. Gene. 2007; 388(1–2): 117–24.
14. Vladychenskaya I.P., Dergunova L.V., Limborska S.A. In vitro and
13. Burns T.A., Subathra M., Signorelli P., Choi Y., Yang X., Wang Y. et
al. Sphingomyelin synthase 1 activity is regulated by the BCR-ABL
oncogene. J. Lipid Res. 2013; 54(3): 794–805.
9. Qureshi A., Subathra M., Grey A., Schey K., Del Poeta M., Luberto
C. Role of sphingomyelin synthase in controlling the antimicrobial
activity of neutrophils against Cryptococcus neoformans. PLoS One.
2010; 5(12): e15587.
PREPARATION OF HUMAN TISSUE
PROTEIN EXTRACTS ENRICHED WITH THE
SPHINGOMYELIN SYNTHASE 1
O. Yu. Sudarkina, L. V. Dergunova
Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences,
Moscow, Russia
Sphingomyelin synthase 1 (SMS1) catalyzes sphingomyelin biosynthesis
in eukaryotic cells. We previously studied the structure
of the human SGMS1 gene, which encodes the enzyme and its
numerous transcripts. The tissue-specific expression of the transcripts
was also described. Analysis of the SMS1 protein expression
in human tissues using immunoblotting of tissue extracts prepared
in the RIPA (Radio Immuno-Precipitation Assay) buffer revealed a
weak signal in renal cortex, testis, lung, and no signal in placenta
and lymphatic node. In this work, a new method of preparation of
the tissue protein extracts enriched with SMS1 was suggested. The
method based on the consecutive extraction with a buffer containing
0.05 and 1 mg/ml of the Quillaja saponaria saponin allowed SMS1
to be detected in all tissues tested. The SMS1 content in the saponin
extract of kidney cortex is about 12-fold higher compared to the
RIPA extraction procedure.
Key words: sphingomyelin synthase 1, saponin, immunoblotting.
41
24.
Ngoka L.C. Sample prep for proteomics of breast cancer: proteomics
and gene ontology reveal dramatic differences in protein solubilization
preferences of radioimmunoprecipitation assay and urea lysis
buffers. Proteome Sci. 2008; 6: 30.
23. Abcam, Western blotting - a beginner’s guide. Available at: http://
www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf
22. Bonifacino J.S., Dell’Angelica E.C., Springer T.A. Immunoprecipitation.
Curr. Protoc. Immunol. 2001; Chapt. 8:Unit 8.3.
19. Wessel D., Flügge U.I. A method for the quantitative recovery of protein
in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analyt.
Biochem. 1984; 138(1): 141–3.
in silico analysis of the predicted human MOB gene encoding a phylogenetically
conserved transmembrane protein. Biomol. Eng. 2002;
18: 263–8.
Стр.2
Институт молекулярной генетики РАН
2·2015
Том 33
Квартальный
научно-теоретический журнал
Основан в январе 1983 г.
РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ:
Главный редактор С. В. КОСТРОВ
Зам. главного редактора Ю. М. РОМАНОВА
Ответственный секретарь Т. С. ИЛЬИНА
В. И. АГОЛ, А. Д. АЛЬТШТЕЙН, А. П. АНИСИМОВ, В. А. ГВОЗДЕВ,
В. Н. ГЕРШАНОВИЧ, А.Л. ГИНЦБУРГ, В. В. ДЕМКИН, A.V. KArlysheV (UK),
Е. Д. КУЗНЕЦОВА (научный редактор), С. А. ЛИМБОРСКАЯ, С. А. ЛУКЬЯНОВ,
V.l. Motin (UsA), Н. Ф. МЯСОЕДОВ, С. В. НЕТЕСОВ, Е. Д. СВЕРДЛОВ,
Г. Б. СМИРНОВ, Н. И. СМИРНОВА,
В. З. ТАРАНТУЛ
РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ:
А. М. БОРОНИН (Пущино-на-Оке), А. А. ПРОЗОРОВ (Москва),
С. В. ШЕСТАКОВ (Москва)
Журнал утвержден в Перечне ведущих научных журналов и изданий, выпускаемых в Российской
Федерации, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций
на соискание ученой степени доктора наук (Бюллетень ВАК)
Журнал полностью переводится на английский язык в США издательством Allerton Press, inC.
МОСКВА «ИЗДАТЕЛЬСТВО "МЕДИЦИНА"»
Стр.3
СОДЕРжАНИЕ
ОбзОРЫ
Афанасьев М.В., Миронова Л.В., Балахонов С.В. MAlDi-toF
масс-спектрометрический анализ для идентификации возбудителей
чумы, холеры и туляремии .................
Калинина О.В., Дмитриев А.В. Структурно-функциональная
организация генома и жизненный цикл вируса гепатита . .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Хоменков В.Г., Скоблов М.Ю., Короленкова Л.И., Киселев
Ф.Л. Клонирование альтернативных изоформ каталитической
субъединицы теломеразы человека (htert) ........
Романова Ю.М., Мулабаев Н.С., Толордава Э.Р., Серегин А.В.,
Серегин И.В., Алексеева Н.В., Степанова Т.В., Левина
Г.А., Бархатова О.И., Гамова Н.А., Гончарова С.А., Диденко
Л.В., Раковская И.В. Микробные сообщества на мочевых
камнях ......................................
Миронова Л.В., Афанасьев М.В., Гольдапель Э.Г., Балахонов
С.В. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов Vibrio
choleraе разной эпидемической значимости . . . . . . . . . . . .
Бывалов А.А., Дудина Л.Г., Чернядьев А.В., Конышев И.В.,
Литвинец С.Г., Оводов Ю.С. Иммунохимическая активность
Б-антигена Yersinia pseudotuberculosis ............
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сударкина О.Ю., Дергунова Л.В. Получение белкового экстракта
тканей человека, обогащенного сфингомиелинсинтазой
.............................................
38
Индекс 71452
для индивидуальных подписчиков
14
3
9
CONTENTS
REVIEWS
Afanas’ev M.V., Mironova L.V., Balakhonov S.V. MAlDitoF
Ms Analysis for Yersinia pestis, Vibrio cholera, and
Francisella tularensis identification
Kalinina O.V., Dmitriev A.V. Genome organization and life
Cycle of the hepatitis C Virus
ExpErimEntal Works
Khomenkov V.G., Skoblov M.Yu., Korolenkova L.I., Kiselev
F.L. Cloning of Alternative isoforms of the Catalytic subunit
of the human thelomerase (htert)
20
26
32
Romanova Yu.M., Mulabaev N.S., Tolordava E.R., Seregin
A.V., Seregin I.V., Alexeeva N.V., Stepanova T.V., Levina
G.A., Barhatova O.I., Gamova N.A., Goncharova S.A.,
Didenko L.V., Rakovskaya I.V. Microbial Communities
on Kidney stones
Mironova L.V., Afanas’ev M.V., Goldapel E.G., Balakhonov
S.V. Multilocus sequence-typing of Vibrio Cholerae strains
with Various epidemic importance
Byvalov A.A., Dudina L.G., Chernyad’ev A.V., Konyshev I.V.,
Litvinets S.G., Ovodov Yu.S. immunochemical Activity of
Yersinia pseudotuberculosis B-Antigen
mEthods of rEsEarch
Sudarkina O.Yu., Dergunova L.V. Preparation of human
tissue Protein extracts enriched with the sphingomyelin
synthase 1
Индекс 72152
для предприятий и организаций
ISSN 0208-0613. Молекул. генетика, микробиология и вирусология, 2015. № 2. 1–40.
Почтовый адрес редакции:
Москва, 109029
115088, ул. Новоостаповская, д. 5, стр. 14
ОАО «Издательство "Медицина"»
Редакция журнала "Молекулярная генетика, микробиология и вирусология"
Тел. редакции: 8 495 678-63-95
e-mail: molgenetika@idm.msk.ru, molgenetika@yandex.ru
Зав. редакцией И. Х. Измайлова
ОТДЕЛ РЕКЛАМЫ
Тел./факс 8-495-678-64-84
E-mail: oao-meditsina@mail.ru
Ответственность
за достоверность информации,
содержащейся в рекламных
материалах, несут
рекламодатели.
Художественный редактор
А. В. Минаичев
Корректор В. С. Смирнова
Переводчик С. К. Чаморовский
Все пpава защищены. Ни одна часть этого
издания не может быть занесена в память
компьютеpа либо воспpоизведена любым
способом без пpедваpительного письменного
pазpешения издателя.
Сдано в набор 11.02.15
Подписано в печать 31.03.15
Формат 60 Ч 88⅛
Печать офсетная. Печ. л. 5,00
Усл.-печ. л. 4,90. Уч.-изд. л. 5,50
Заказ 251
ЛР №010215 от 29.04.97 г.
www.medlit.ru
Отпечатано в типографии ООО "Подольская
Периодика",
142110, г. Подольск, ул. Кирова, 15
© ОАО «Издательство "Медицина"», 2015
2
Стр.4
ОБЗОРы
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
УДК 579.841.95+579.842.23+579.843.1].083.18
Афанасьев М.В., Миронова Л.В., Балахонов С.В.
maldi-tof МАСС-СПЕКТРОМЕТРИчЕСКИЙ АНАЛИз ДЛЯ ИДЕНТИфИКАЦИИ
ВОзбУДИТЕЛЕЙ чУМЫ, хОЛЕРЫ И ТУЛЯРЕМИИ
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора,
664047, г. Иркутск
В представленном обзоре рассматриваются общие вопросы методологии
новой технологии в лабораторной диагностике инфекций
– MAlDi-toF Ms-анализа (Matrix-Assisted lazer Desorption/ionization
time-of-Flight Mass spectrometry; матричноактивированная
лазерная десорбционно-ионизационная
времяпролетная масс-спектрометрия), а также ряд частных
вопросов, касающихся использования данной технологии в
идентификации и типировании возбудителей особо опасных
инфекций – чумы, холеры и туляремии. Обсуждается проблема
пробоподготовки образцов к исследованию и обеспечение биологической
безопасности.
Ключевые слова: MALDI-ToF MS-анализ; MALDI-ToF
MS-идентификация; Yersinia pestis; Vibrio cholera; Francisella
tularensis.
Общие сведения о maldi-tof масс-спектрометрии
Одним из наиболее активно развивающихся в последние
годы направлений в лабораторной диагностике
инфекционных заболеваний является технология
MAlDi-toF Ms (Matrix-Assisted lazer Desorption/ionization
time-of-Flight Mass spectrometry – матричноактивированная
лазерная десорбция/ионизация с
времяпролетным разделением) [1]. В основе метода
MAlDi-toF лежит процедура мягкой ионизации исследуемого
материала (аналита), позволяющая в присутствии
особого вещества, так называемой матрицы,
под воздействием лазера ионизировать биологические
макромолекулы (пептиды, белки, ДНК, олигонуклеотиды,
липополисахариды и сахара) без их фрагментации
и деструкции. Матрица – вещество кислой природы,
которое, будучи сокристаллизованным с аналитом, при
воздействии лазерного импульса обеспечивает передачу
энергии лазера молекулам исследуемого объекта,
ионизируя их и переводя в газовую фазу [2]. В качестве
матриц используются вещества как сложной органической,
так и неорганической природы [3, 4]. Наиболее
широко применяется α-циано-4-гидроксикоричная кислота
(англ. α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; ChCA), синапиновая
кислота (англ. sinapinic acid; sA), феруловая
кислота (ferulic acid; FA) и дигидробензойная кислота
(англ. 2,5-dihydroxybenzoic acid; DhB) [5, 6].
После десорбции преимущественно однозарядные
ионизированные молекулы ускоряются в электрическом
поле, попадают в разделительную часть прибора (представляющую
собой трубу, в полости которой поддерживается
вакуум), по прохождении которой ионы достигают
детектора. Скорость движения и, соответственно,
время прохождения расстояния от точки ионизации до
детектора, обратно пропорционально массе ионов. Зная
длину пути перемещения иона от ионизатора до детектора,
а также время этого перемещения, можно вычислить
скорость движения иона и, на основании ее значения,
рассчитать массу частиц, присутствующих в аналите,
а также генерировать спектр, характеризующий качественный
состав исследуемого объекта.
3
Одной из основных областей применения MAlDitoF
Ms-анализа в биологии и медицине традиционно
считалась клиническая и биологическая химия, в которой
данный метод использовался для качественной и количественной
детекции биомолекул различной природы
в клиническом материале: сыворотке крови, моче, слюне,
цереброспинальной жидкости, слезах, фрагментах
тканей [7].
Для исследования микроорганизмов MAlDi-toF Ms
впервые был применен достаточно давно, в середине 70-х
годов прошлого века [8], однако активное внедрение этого
метода в практику лабораторной диагностики началось
в последнее десятилетие. Во многом это было связано с
совершенствованием приборной базы, накоплением фактического
материала о возможностях технологии массспектрометрического
анализа для идентификации и углубленной
характеристики микроорганизмов.
Идентификация микроорганизмов с использованием
MAlDi-toF Ms осуществляется путем сравнения
белкового спектра исследуемого штамма с базовой
коллекцией спектров референсных микроорганизмов
известных видов. На основании степени соответствия
спектров определяется принадлежность исследуемого
микроорганизма к определенному виду (роду) [9].
Кроме того, существует алгоритм идентификации, при
котором значения масс ионов в полученном спектре неизвестного
микроорганизма сравниваются с массами
белков, аннотированных в протеомных базах данных и/
или предсказанных на основании нуклеотидных последовательностей
геномов [10, 11].
В процессе экспериментальных исследований установлено,
что большая часть пиков спектра, особенно в
диапазоне от 4 до 15 кД, соответствует белкам. Среди
них преобладают интактные или прошедшие посттрансляционную
модификацию рибосомальные белки – до
половины пиков, представленных в спектре. Так же достаточно
стабильно в спектре детектируются белки холодового
шока и ДНК-связывающие белки [12–14].
Процедура выполнения MAlDi-toF Ms-анализа
достаточно проста и не требует большого количества
времени и специальных навыков персонала. Для исследования
необходима чистая культура микроорганизма
(единичная изолированная колония), забранная в экспоненциальной
фазе роста. Далее возможно нанесение на
специальную металлическую подложку – мишень либо
чистой культуры без дополнительной обработки, либо
экстракта, полученного после предварительной обработки
суспензии исследуемой культуры физическими
или химическими методами [15–17]. В последние годы
разрабатывается ряд подходов, позволяющих проводить
прямую идентификацию возбудителя в некоторых видах
клинического материала, таких как моча, цереброспинальная
жидкость, кровь [18–20].
Стр.5