МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
СПЕЦПРАКТИКУМ
ПО БИОЭНЕРГЕТИКЕ
Учебно-методическое пособие для вузов
Составители:
А.П. Гуреев, М.Ю. Сыромятников,
В.Н. Попов
Воронеж
Издательский дом ВГУ
2017
Стр.1
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................. 4
ТЕМА 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИНТАКТНЫХ
МИТОХОНДРИЙ ....................................................................................................................... 6
ТЕМА 2. ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ИЗ ПЕЧЕНИ МЫШИ. ИЗМЕРЕНИЕ
МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА ........................................................................................ 10
ТЕМА 3. ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ СКОРОСТИ ДЫХАНИЯ
МИТОХОНДРИЙ. ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ.............................................................. 18
ТЕМА 4. ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ КАЛЬЦИЯ МИТОХОНДРИЯМИ .................... 22
ТЕМА 5. ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ИЗ МОЗГА МЫШИ ....................................... 26
ТЕМА 6. ИЗМЕРЕНИЕ ПРОДУКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В
МИТОХОНДРИЯХ МОЗГА ................................................................................................... 31
3
Стр.3
ТЕМА 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ
ИНТАКТНЫХ МИТОХОНДРИЙ
Цель занятия: Введение в митохондриологию, ознакомление с методикой
приготовления сред для выделения митохондрий. Сравнение сред для
выделения митохондрий из различных тканей.
Основные теоретические положения: Среды для выделения и инкубации
митохондрий по плотности и своему ионному составу должны
максимально соответствовать естественному окружению митохондрий, то
есть цитозолю. Главными компонентами сред для выделения и инкубации
митохондрий являются сахара, буферные растворы и хелаторы.
Среди сахаров, являющихся основными осмотически активными компонентами
сред, обычно используется сахароза и маннитол. Сахароза, или
столовый сахар - это димер глюкозы и фруктозы. Молекулярная масса сахарозы
342,3 г/моль, плотность 1,588. Сахароза имеет очень высокую растворимость
– 200 г/100 мл воды, поэтому с ее помощью легко варьировать
плотности буферов для различных целей. Маннитол, или D-Маннит является
одним из сахаров с гидроксильными (ОН-) группами, поэтому имеет некоторые
химические свойства спиртов. Молекулярная масса маннитола
82,17 г/моль, плотность 1,489. Маннитол осмотически более активен, чем
сахароза, но его использование обусловлено наличием OH--групп, что защищает
митохондрии от повреждений радикалами кислорода, особенно
гидроксил-радикалами.
Среди буферов самым распространенным в биологических исследованиях
является Трис-HCl (Tris-HCl). При температуре 25°C он имеет величину
рКа = 8,06. Это предполагает, что эффективный предел буферной емкости
находится между рН 7,1 и 9,0. Однако многие авторы отмечали неко6
Стр.6
торую токсичность Трис-HCl для митохондрий. Поэтому при работе с митохондриями
наибольшей популярностей пользуется ХЕПЕС (HEPES) (4(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан-сульфоновая
кислота). ХЕПЕС является
органическим буфером цвиттер-ионом, то есть в одной молекуле содержатся
кислотные и щелочные группы. ХЕПЕС оптимально подходит для сред
выделения и инкубации, поскольку он имеет максимальную буферную емкость
при рН 3,0 и при нормальном физиологическом значении рН цитоплазмы
клеток 7,5.
Хелаторы являются обязательными компонентами сред для выделения
и инкубации митохондрий. Основное свойство хелаторов заключается в
связывании ионов металлов, что имеет большое значение для митохондрий,
способных аккумулировать значительное количество ионов Ca2+. Большое
количество Ca2+ выделяется при гомогенизации тканей. Это оказывает негативное
влияние на целостность внутренней мембраны митохондрий и, как
следствие, на качество интактных препаратов митохондрий.
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) представляет собой хелатор
с высокой специфичностью для двухвалентных катионов, таких как
Cu2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+ и Fe2+. Но его использование имеет также негативные
последствия для митохондрий, так как удаление ионов Mg2+ ведет к конформационным
изменениям, в результате чего протонная проводимость
внутренней мембраны увеличивается, и мембранный потенциал падает. Более
того, ЭДТА меняет кинетику взаимодействия митохондриальных ферментов
с АТФ и АДФ, так как в нормальных условиях АТФ практически
полностью находится в комплексе с Mg2+. Именно по этой причине в качестве
хелаторов в средах для работы с митохондриями используется не
ЭДТА, а ЭГТА.
7
Стр.7
ЭГТА (этиленгликольтетрауксусная кислота) имеет намного большую,
в сравнении с ЭДТА, специфичность по отношению к ионам кальция.
Специфичность ЭГТА к ионам Mg2+ в 10000 раз ниже, чем к Ca2+.
БСА (бычий сывороточный альбумин) не является строго обязательным
компонентом сред для работы с митохондриями, но он улучшает качество
препаратов, поскольку устраняет разобщающее действие жирных кислот.
Рекомендуется использовать БСА только в среде выделения и не добавлять
БСА в среду для промывки митохондрий. В живых клетках сывороточные
альбумины имеют две главные функции – транспортную и создание
так называемого онкотического давления.
Классически для выделения митохондрий используется 2 типа сред:
среда для выделения (с БСА), в которой производится гомогенизация и первое
центрифугирование, и среда для промывки (без БСА), в которой производятся
все дальнейшие работы. Измерение биоэнергетических характеристик
(кроме поглощения Ca2+) проводят в среде измерения, но также допускается
измерение и в среде для выделения (с БСА).
Работа 1. Приготовление сред для выделения и работы с митохондриями
Материалы
и оборудование. Электронные весы; pH-метр; маннитол,
сахароза, EGTA, HEPES, БСА, KCl, NaCl, KH2PO4, MgCl2, KOH.
Ход работы:
Замечание 1. Для выделения митохондрий печени лучше всего использовать
чистую сахарозную среду. Это связано с тем, что при гомогенизации
печени в гомогенате содержится очень много эритроцитов. Маннитол
8
Стр.8
вызывает набухание эритроцитов, в результате чего избавиться от них
без дополнительных процедур достаточно сложно.
1.
Рассчитать массу компонентов на объем 300 мл:
Табл. 1. Компоненты сред для выделения митохондрий из печени
Компонент
Сахароза
HEPES
EGTA
Концентрация
250 мМ
10 мМ
1 мМ
БСА (только для среды выделения)
2 мг/мл
Табл. 2. Компоненты сред для выделения митохондрий из мозга
Компонент
Маннитол
Сахароза
HEPES
EGTA
Концентрация
225 мМ
75 мМ
5 мМ
1 мМ
БСА (только для среды выделения)
2 мг/мл
Табл. 3. Компоненты сред для измерения биоэнергетических параметров митохондрий
(предпочтительно на 100 мл)
Компонент
KCl
HEPES
NaCl
KH2PO4
Концентрация
125 мМ
20 мМ
14 мМ
4 мМ
9
Стр.9
MgCl2
EGTA
1 мМ
БСА (только для среды выделения)
0,2 мМ
1 мг/мл
2. Взвесить необходимое количество компонентов для приготовления
среды для выделения и среды для промывки. Растворить в 300 мл дистиллированной
воды.
3. Довести значения pH сред до нормального физиологического значения
pH цитозоля 7,2 – 7,4, используя сухой KOH.
4. Хранить среды при +4°C в течение нескольких недель.
Замечание 2. Все среды рекомендуется хранить в стеклянной таре.
Ни в коем случае не допускается ее длительное хранение в пластиковой посуде,
так как происходит обогащение среды перекисью водорода.
ТЕМА 2. ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ИЗ ПЕЧЕНИ МЫШИ.
ИЗМЕРЕНИЕ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА
Цель занятия: освоение и закрепление метода выделения интактных
митохондрий из печени мыши. Ознакомление с методом измерения мембранного
потенциала.
Основные теоретические положения: Митохондрии печени имеют
уникальные свойства, которых нет у митохондрий других органов. Например,
сильная зависимость функций от метаболического состояния органа,
что позволяет оценивать влияние тех или иных препаратов на митохондриальные
функции. Митохондрии печени обладают высокой устойчивостью к
10
Стр.10