МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
ОСНОВЫ
БИОНАНОТЕХНОЛОГИИ
Учебно-методическое пособие
Составители:
М.А. Наквасина,
В.Г. Артюхов
Воронеж
Издательский дом ВГУ
2016
1
Стр.1
ПРЕДИСЛОВИЕ
С 2014–2015 учебного года на биолого-почвенном факультете реализуется
дисциплина «Основы бионанотехнологии» для студентов 4-го курса
очной и 5-го курса очно-заочной формы обучения. В ходе изучения основ
бионанотехнологии обучающиеся знакомятся с перспективными направлениями
нанотехнологий, бионанотехнологий и наномедицины. Главное внимание
в программе дисциплины уделяется изучению наночастиц как наиболее
развитому направлению нанотехнологических разработок. Рассматриваются
основные методы характеризации наноструктур и наноматериалов,
особенности наночастиц, обеспечивающие проявление их свойств, отличных
от таковых для макроматериалов и важные для их биомедицинского
применения. Студенты получают представление о типах наночастиц, применяющихся
в биомедицинских исследованиях, их свойствах, преимуществах
и недостатках, особенностях «функционализации», путях поступления в
организм, механизмах проникновения в клетки и их модифицирующего
воздействия на структурно-функциональное состояние биомолекул, клеток
и внутриклеточных компонентов. Обсуждаются вопросы и проблемы, связанные
с необходимостью осуществления контроля биоактивности, биобезопасности
и токсичности наночастиц по отношению к биосистемам различного
уровня организации.
Дополнением к теоретическому курсу, основное содержание которого
на данный момент изложено в учебном пособии М.А. Наквасиной, В.Г. Артюхова
«Бионанотехнологии: достижения, проблемы, перспективы развития»
(2015), является настоящее учебно-методическое пособие, предназначенное
для проведения лабораторных занятий. В нем представлена краткая
характеристика наночастиц, используемых в биомедицине, и техногенных
наночастиц, описаны методы их исследования, а также лабораторные работы,
направленные на приобретение и развитие навыков получения липосом и
введения в них биомолекул, исследования действия наночастиц фотосенсибилизаторов,
серебра, углерода, хитозана на структурно-функциональное состояние
опухолевых, эритроцитарных и лимфоцитарных клеток и их компонентов.
Применительно к каждой теме изложены теоретические представления
о структуре и свойствах наночастиц, особенностях их биологического
действия, направлениях использования; дано описание лабораторных работ,
а в конце темы приводятся контрольные вопросы. Лабораторные работы различного
уровня сложности рассчитаны на выполнение студентами разных
профилей направления подготовки «Биология», специализирующимися как
на классических, так и экспериментальных кафедрах, т.е. они адаптированы
к уровню их физико-химических и математических знаний.
В учебно-методическом пособии отражены современные тенденции
междисциплинарного взаимодействия биофизики, биотехнологии, иммуно3
Стр.3
В основе создания современных терапевтических и диагностических
препаратов лежит применение наночастиц в качестве платформ, на поверхности
которых производят сборку различных функциональных компонентов:
лекарственных веществ, средств визуализации очагов патологии, компонентов,
обеспечивающих эффективную доставку наночастиц в целевые
клетки (мишени) организма.
Наиболее важными для биомедицинского применения являются свойства
наночастиц: малые размеры — от 1 до 100 нм, высокая удельная поверхность,
локализация реактивных групп на поверхности наночастицы.
Эти особенности наночастиц существенно изменяют их физико-химические
и биологические свойства по сравнению с более крупными частицами того
же состава, а именно: растворимость, реакционную способность, адсорбционную
емкость, способность к агрегации, прочность. Малый размер наночастиц
позволяет им непосредственно взаимодействовать с биомолекулами на
поверхности и внутри клеток, что приводит к изменениям функций различных
биологических структур.
При создании наночастиц с заданными свойствами возможен контроль
их строения вплоть до пространственной структуры каждой составляющей
молекулы. На основе наночастиц (в том числе модифицированных)
создают «мультифункциональные» системы, позволяющие направлять доставку
лекарственных веществ и средств диагностики в очаги патологии, ограничивая
его неспецифическое распространение, подбирать оптимальную
дозу препарата и пролонгировать время удержания его в организме. Применение
наночастиц в качестве носителей (платформ) лекарственных веществ
дает возможность использовать препараты с низкой растворимостью или
нерастворимые в воде, характеризующиеся низкой биодоступностью, нестабильные
и токсичные соединения.
«Функционализация» наночастиц — это «присоединение» к ним лекарственных
препаратов, средств построения изображений, вспомогательных
лигандов. Она может происходить за счет их инкапсуляции, ковалентного
пришивания к поверхности или адсорбции. Наиболее важной модификацией
наночастиц является нагрузка их молекулами лекарственного соединения
или антигенными детерминантами.
Важным свойством наночастиц при медицинском использовании является
их способность преодолевать физиологические барьеры: гематоретинальный,
гематоэнцефалический.
Возможны различные способы введения в организм лекарственных
препаратов на основе наночастиц, в том числе, внутриглазное, назальное,
пульмональное, которые невозможно использовать в случае традиционных
лекарственных средств.
Основными направлениями исследований, связанных с разработкой и
внедрением в практику средств диагностики и терапии на основе наноча6
Стр.6
стиц в медицине, в настоящее время служит создание препаратов для лечения
и диагностики вирусных и онкологических заболеваний.
При терапии вирусных заболеваний используют в основном немодифицированные
наночастицы и неадресную доставку препаратов. Для разработки
терапевтических средств при онкозаболеваниях приоритетным является
создание интегрированных, направленных «мультифункциональных»
наносистем для одновременной диагностики, биомаркирования и лечения.
В этом случае необходим поиск путей адресной (таргетной) доставки
«мультифункциональных» наночастиц и более эффективного их распределения
и накопления в специфических тканях.
Системы доставки лекарственных и диагностических препаратов на
основе наночастиц условно подразделяют на несколько классов: биологические
и биогенные, в состав которых входят материалы природного происхождения,
либо синтетические биомолекулы и их фрагменты природного
строения; полимерные наночастицы, при создании которых используются
неприродные мономерные и полимерные материалы; неорганические и наночастицы
на основе углерода (табл. 1).
Т а б л и ц а 1
Системы доставки лекарственных и диагностических препаратов
на основе наночастиц
нанотранспортных
систем
доставки
Классы
Используемые материалы
Биологические
и биогенные
Полимерные
Нуклеиновые кислоты
Полисахариды
Вирусы
Липиды
Пептиды
Полимолочная кислота
Полигликолевая кислота
Полиалкилцианоакрилат
Поли-3-гидроксибутановая
кислота
Полиэтиленгликоль
Поликапролактон
Полиэтиленоксид
Полиамидоамин
Полиэтиленимин
Полипропиленимин
Полиметилметакрилат
7
Типы наночастиц
вирусоподобные наночастицы,
микросферы, собственно
наночастицы (наносферы
и нанокапсулы)
Липосомы, липоплексы,
вирусные наночастицы,
Микросферы, собственно
наночастицы (наносферы
и нанокапсулы), мицеллы,
дендримеры
Стр.7
О к о н ч а н и е т а б л. 1
Неорганические
Наноструктуры
на основе
углерода
Оксиды металлов
Соли металлов
Кремний
Металлы
Углерод
наностержни, наносферы,
нанооболочки
Неорганические
наночастицы,
квантовые точки,
Углеродные нанотрубки,
фуллерены
Отличительной особенностью биологических и биогенных наноструктурированных
систем доставки является их способность к самоорганизации
и молекулярному узнаванию мишени (биомолекула, биосистема,
клетка). Это свойство активно используется при создании искусственных
конструкций, имитирующих реальные биологические структуры. Биогенные
наночастицы не токсичны для организма, биосовместимы, биодеградируемы,
поэтому активно используются в биомедицинских разработках.
Техногенные наночастицы
В настоящее время в мире наблюдается значительный рост объемов
производства новых материалов, содержащих наноразмерные техногенные
частицы, и расширение областей их применения.
Экспертами Межведомственной программы по корректному управлению
химическими препаратами и Организации экономической кооперации
и развития разработан перечень приоритетных наночастиц для характеристики
их биологического действия и обеспечения безопасности (табл. 2).
Приоритетные техногенные наночастицы производятся или в ближайшее
время будут производиться в больших объемах; оказывают воздействие на
жизненно важные системы организма.
Т а б л и ц а 2
Характеристика некоторых приоритетных техногенных наноматериалов
Тип
Области
наноматериала
Фуллерены
преимущественного
применения
Создание композитных материалов
со сверхпроводящими свойствами;
смазочных материалов; в
микроэлектронике и оптике, в
солнечных элементах, электрических
батареях и аккумуляторах;
для покрытий эндопротезов
8
Потенциальные угрозы
для безопасности человека
Связаны с усилением пероксидного
окисления липидов. При
облучении видимым и УФсветом
проявляют фотосенсибилизирующую
активность.
Основная проблема биобезопасности
— воздействие через
Стр.8
П р о д о л ж е н и е т а б л. 2
(титан-фуллереновые композитные
материалы); в биомедицине
в качестве контрастирующих
агентов для ЯМР-томографии
Углеродные
нанотрубки
Широко применяются в электронике
и компьютерной индустрии;
входят в состав композиционных
материалов. Используются
в бионанотехнологических
разработках
кожу при прямом применении
фуллеренсодержащих препаратов
Общий
механизм токсического
действия — индукция окислительного
стресса, стимулирующего
воспалительные, генотоксические
и цитотоксические последствия.
В окружающей среде
— нанодиспергированный
углерод, который может усиливать
воспалительные процессы в
легких. Основные риски для человека
— при хронических ингаляциях,
особенно в производственных
условиях
Наночастицы
золота
В бионанотехнологии и наномедицине
(на основе явления
плазмонного резонанса — резонансного
поглощения нанокластером
падающего электромагнитного
излучения, которое используется
для диагностики и
гипертермии опухолей)
Наночастицы
серебра
Покрытия для поглощения солнечной
энергии; катализаторы химических
реакций; антимикробные
и дезинфицирующие средства;
компоненты пищевых упаковок.
Добавки наносеребра придают
антибактериальные свойства
одежде, краскам, эмалям. Используются
в бионанотехнологии и
наномедицине
Наночастицы
оксида алюминия
(Al2O3)
Изготовление покрытий для деталей
машин; входят в состав
огнеупорных красок, сорбентов,
электронных устройств
Могут вызывать воспалительные
реакции, накапливаться в
ретикулярных клетках лимфоидной
ткани, печени; влияют на
клеточный и гуморальный иммунитет.
Неблагоприятные клеточные
и организменные эффекты
связывают с малыми размерами,
а также с освобождением
ионов с поверхности наночастиц
Токсические эффекты возникают
из-за сочетания свойств
наночастиц и высвобождения
ионов серебра. Высоко стабильны
в окружающей среде,
способны длительно сохранять
токсические свойства
Снижение уровня жизнеспособности
клеток, изменение
митохондриального потенциала,
нарушения экспрессии генов,
проникновение через гематоэнцефалический
барьер,
нейротоксичность
9
Стр.9
О к о н ч а н и е т а б л. 2
Наночастицы
оксида церия
(CeO2)
Наночастицы
диоксида кремния
(SiO2)
В катализе; солнечных ячейках;
люминесцентных преобразователях;
абразивах; газовых сенсорах
Широко используются как один
из самых дешевых наноматериалов
в микроэлектронике, оптоэлектронике,
электротехнике.
Наночастицы
SiO2 входят в состав
средств огнезащиты, термически
устойчивых лакокрасочных
покрытий, высокотемпературных
клеев, огнеупорного
стекла, пеногасителей, красок,
антикоррозионных
покрытий,
строительных смесей; используются
при производстве силикона,
резины, каучука, полимеров,
бетона, герметиков, бумаги.
Применяются в бионанотехнологических
разработках
Наночастицы
оксидов цинка
(ZnO) и титана
(TiO2)
Диоксид титана — в лакокрасочной
промышленности; разрешенная
к применению микродисперсная
пищевая добавка
Е171. ZnO и TiO2 входят в состав
косметических средств, зубной
пасты, солнцезащитных кремов;
компоненты пластиков и текстильных
материалов
Индукция активных форм кислорода,
накопление в органах,
влияние на иммунные клетки,
цитотоксичность
Цитотоксичность как следствие
развития окислительного
стресса
Увеличение уровня активных
форм кислорода в клетках, цитотоксичность,
индукция воспалительных
реакций
Высокая биологическая активность техногенных наночастиц обусловливает
потенциальные риски возникновения нежелательных токсических
эффектов для работников нанотехнологических предприятий и потребителей
продукции наноиндустрии. В этой связи в настоящее время закладываются
основы систем контроля рисков, связанных с использованием нанотехнологической
продукции, и определения степени потенциальной
опасности новых наноматериалов.
Важнейшим элементом работ по нанобезопасности является стандартизация
характеристик наночастиц. Минимальный набор параметров для
стандартизации наночастиц включает показатели: размер (распределение по
размерам), форму, кристалличность, наличие агломерации / агрегации, характеристики
поверхностных свойств (площадь поверхности, пористость,
10
Стр.10