КУЛЬТУРА
ЖИВОТНЫХ
КЛЕТОК
ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО
Р. Я. Фрешни
Перевод 6-го английского издания
5-е издание, электронное
Лаборатория знаний
2022
Москва
Стр.4
УДК 57.08
ББК 28.03
Ф87
д-р биол. наук Ю. Н. Хомяков,
канд. мед. наук Т. И. Хомякова
П е р е в о д ч и к и:
Фрешни Р. Я.
Ф87 Культура животных клеток : практическое руководство /
Р. Я. Фрешни ; пер. 6-го англ. изд. — 5-е изд., электрон. —
М. : Лаборатория знаний, 2022. — 791 с. — Систем. требования:
Adobe Reader XI ; экран 10". — Загл. с титул. экрана. — Текст :
электронный.
ISBN 978-5-00101-974-9
Учебное издание, написанное ведущим специалистом в данной области,
содержит наиболее полное описание теоретических основ и практических
приемов работы с культурами животных клеток, а также необходимого
оборудования, включая лабораторный дизайн. В достаточном объеме освещены
вопросы техники безопасности. Подробно обсуждаются методика
подготовки сред, приемы работы с первичной культурой и клеточными
линиями. Описано специальное оборудование, в том числе для манипуляций
с культурами животных клеток. Книга прекрасно иллюстрирована и удобна
для использования как руководство в лаборатории.
Для студентов-биологов, биотехнологов, медиков, а также исследователей,
специалистов биофармацевтических центров и сотрудников диагностических
лабораторий.
УДК 57.08
ББК 28.03
Приведенные в книге показания к применению, противопоказания и дозировки препаратов настоятельно рекомендуется
сверять с информацией их производителей и соотносить с клиническими процедурами.
Авторы, редакторы и издатель не несут никакой юридической ответственности за любые содержащиеся в тексте
и иллюстрациях ошибки или упущения.
В соответствии со ст. 1299 и 1301 ГК РФ при устранении ограничений, установленных техническими
средствами защиты авторских прав, правообладатель вправе требовать от нарушителя возмещения убытков
или выплаты компенсации
Copyright © 2010 by John Wiley & Sons. Inc. All rights reserved.
Все права защищены. Авторизованный перевод издания
на английском языке, опубликованного John Wiley & Sons
Limited. Ответственность за точность перевода полностью
возложена на издательство Лаборатория знаний и не является
ответственностью John Wiley & Sons Limited. Никакая часть
данной книги не может быть воспроизведена в любой форме
без письменного разрешения первоначального правообладателя,
John Wiley & Sons Limited.
ISBN 978-5-00101-974-9
© Перевод на русский язык, оформление, Лаборатория знаний,
2015
Стр.5
Оглавление
Список иллюстраций . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Список цветных вклеек . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Список протоколов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Список таблиц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Предисловие и благодарности . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Список сокращений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Глава 1 ВВЕДЕНИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.1.
1.2.
Исторические сведения . . . . . . . . . . . . . . . 30
Преимущества культуры ткани . . . . . . . 35
1.2.1. Контроль окружающей среды . . . . . . . . . . . 35
1.2.2. Характеристика и однородность образцов 36
1.2.3. Экономичность, эффективность и автоматизация
процесса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.2.4. Моделирование in vitro условий in vivo . . . 36
1.3.
Ограничения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.3.1. Наличие специальных навыков . . . . . . . . . 36
1.3.2. Затраты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.3.3. Дифференцировка и селекция . . . . . . . . . . 37
1.3.4. Происхождение клеток . . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.3.5. Нестабильность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
1.4.
1.5.
Основные отличия культуры in vitro . . . 38
Типы культуры ткани . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Глава 2 БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.1.
2.2.
Влияние окружающей среды на культуру
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Клеточная адгезия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.2.1. Молекулы клеточной адгезии . . . . . . . . . . . 41
2.2.2. Межклеточные контакты . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.2.3. Внеклеточный матрикс . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.2.4. Цитоскелет . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.2.5. Клеточная подвижность . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.3.
Клеточная пролиферация . . . . . . . . . . . . . 45
2.3.1. Клеточный цикл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.3.2. Контроль клеточной пролиферации . . . . . . 46
2.4.
Дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.4.1. Поддержание дифференцировки . . . . . . . . 47
2.4.2. Дедифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.5.
2.6.
2.7.
Передача клеточных сигналов . . . . . . . . 50
Энергетический метаболизм . . . . . . . . . . 51
Происхождение культивируемых клеток
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.7.1. Получение первичной культуры . . . . . . . . . 52
2.7.2. Эволюция клеточных линий . . . . . . . . . . . . 53
2.7.3. Старение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.7.4. Трансформация и развитие постоянных
клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Глава 3 СТРУКТУРА, ПЛАНИРОВКА И ОБОРУДОВАНИЕ
ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.1.
Планировка, меблировка и оборудование
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.1.1. Требования к помещениям . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.2. Обслуживание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.1.3. Вентиляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.2.
Планировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.2.1. Помещение для стерильных манипуляций 61
3.2.2. Ламинарное оборудование . . . . . . . . . . . . . 62
3.2.3. Служебный лабораторный стол . . . . . . . . . 62
3.2.4. Карантин и изоляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.2.5. Инкубация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.2.6. Зона подготовительных работ . . . . . . . . . . . 66
3.2.7. Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Глава 4 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ . . . . 70
4.1.
4.2.
Потребности лаборатории культуры
ткани . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
Асептическая зона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.2.1. Ламинарные шкафы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.2.2. Сервисные тележки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.3. Стерильные манипуляции с жидкостями —
пипетирование и дозирование . . . . . . . . . . 75
4.2.4. Инвертированный микроскоп . . . . . . . . . . . 79
4.2.5. CCD-камера и монитор . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.2.6. Препаровальная лупа . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.2.7. Центрифуга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.2.8. Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.3.
Инкубация и культура . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.3.1. Инкубатор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.3.2. Влажный СО2-инкубатор . . . . . . . . . . . . . . 81
4.3.3. Регистратор температуры . . . . . . . . . . . . . . 83
4.3.4. Роллерные штативы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.3.5. Магнитная мешалка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.3.6. Культуральные сосуды . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.4.
Препаративные работы и стерилизация
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.4.1. Мытье посуды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.4.2. Приготовление сред и реактивов . . . . . . . . 84
4.4.3. Стерилизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.5.
Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.5.1. Расходные материалы . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
Стр.6
6
Оглавление
4.5.2. Холодильники и морозильники . . . . . . . . . 88
4.5.3. Контейнеры для криоконсервации . . . . . . . 88
4.5.4. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг
с управляемым процессом замораживания 89
4.6.
Дополнительное лабораторное оборудование
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.6.1. Компьютеры и cети . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.6.2. Прямой микроскоп . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.6.3. Низкотемпературный морозильник . . . . . . 89
4.6.4. Конфокальный микроскоп . . . . . . . . . . . . . 90
4.6.5. PCR-термоциклер (ДНК-амплификатор) . . 90
4.7.
Специальное оборудование . . . . . . . . . . . 90
4.7.1. Установка для микроинъекций . . . . . . . . . . 90
4.7.2. Счетчик колоний . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
4.7.3. Центрифужный элютриатор . . . . . . . . . . . . 90
4.7.4. Проточный цитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
Глава 5 МЕТОДЫ АСЕПТИКИ . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.1.
Цели асептики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.1.1. Риск контаминации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.1.2. Поддержание стерильности . . . . . . . . . . . . 91
5.2.
Элементы асептического окружения . . . 91
5.2.1. Ламинарный поток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.2.2. Стерильная зона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2.3. Рабочая поверхность . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.2.4. Личная гигиена . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2.5. Реагенты и среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2.6. Культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.3.
Стерильные манипуляции . . . . . . . . . . . . 97
5.3.1. Протирание поверхностей . . . . . . . . . . . . . . 97
5.3.2. Закрывание емкостей . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
5.3.3. Работа с горелкой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
5.3.4. Манипуляции с бутылями и колбами . . . . . 97
5.3.5. Пипетирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
5.3.6. Переливание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
5.4.
Стандартная процедура . . . . . . . . . . . . . . 99
Протокол 5.1. Асептический метод работы
в вертикальном ламинарном потоке
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
Протокол 5.2. Работа на открытой поверхности
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
5.5.
Протокол 5.3. Работа с планшетами
и чашками . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Приборы и оборудование . . . . . . . . . . . . . 104
5.5.1. Инкубаторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
5.5.2. Коробки для влажного инкубатора . . . . . . . 104
5.5.3. Культивирование в атмосфере СО2 . . . . . . . . . 104
Глава 6 БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАЛИДАЦИЯ
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
Лабораторная безопасность . . . . . . . . . . . 105
Оценка риска . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
Стандартные рабочие процедуры . . . . . . 107
Контроль безопасности . . . . . . . . . . . . . . . 107
Общая безопасность . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
6.1.
6.2.
6.3.
6.4.
6.5.
6.5.1. Оператор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
6.5.2. Оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
6.5.3. Стеклянные и острые предметы . . . . . . . . . 108
6.5.4. Химическая токсичность . . . . . . . . . . . . . . . 110
6.5.5. Газы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.5.6. Жидкий азот . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.5.7. Ожоги . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.6.
6.7.
Пожар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Ионизирующее излучение . . . . . . . . . . . . 112
6.7.1. Попадание в организм . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
6.7.2. Утилизация радиоактивных отходов . . . . . 112
6.7.3. Излучение от меченых реагентов . . . . . . . . 112
6.7.4. Излучение от высокоэнергетических источников
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Биологическая опасность . . . . . . . . . . . . . 113
6.8.
6.8.1. Уровни биологической защиты . . . . . . . . . 113
6.8.2. Ламинарные шкафы микробиологической
защиты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
6.8.3. Человеческий биопсийный материал . . . . . 116
6.8.4. Манипуляции с генетическим материалом 119
6.8.5. Уничтожение биологически опасных отходов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.8.6. Дезинфекция окуриванием . . . . . . . . . . . . . 120
6.9.
Биоэтика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.9.1. Ткани животных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.9.2. Ткани человека . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.10.
Обеспечение качества . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6.10.1. Процедуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
6.10.2. Контроль качества . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
6.11.
Валидация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
6.11.1. Подтверждение аутентичности . . . . . . . . . . 122
6.11.2. Происхождение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
6.11.3. Контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
Глава 7 ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . 124
Субстрат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
7.1.
7.1.1. Прикрепление и рост клеток . . . . . . . . . . . . 124
7.1.2. Общепринятые материалы для субстрата . 124
7.1.3. Альтернативные субстраты . . . . . . . . . . . . . 124
7.2.
Обработка поверхности . . . . . . . . . . . . . . 125
7.2.1. Покрытие матриксом . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Протокол 7.1. Приготовление ECM . . . . . 126
7.2.2. Фидерные слои . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
7.2.3. Неадгезивные субстраты . . . . . . . . . . . . . . . 126
7.3.
Выбор культуральных сосудов . . . . . . . . 127
7.3.1. Клеточный выход . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
7.3.2. Суспензионная культура . . . . . . . . . . . . . . . 129
7.3.3. Вентиляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
7.3.4. Отбор и анализ проб . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
7.3.5. Неравномерный рост . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
7.3.6. Расходы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
7.4.
Специализированные системы . . . . . . . . 133
7.4.1. Проницаемые подложки . . . . . . . . . . . . . . . 133
7.4.2. Трехмерные матриксы . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
Глава 8 СРЕДЫ И ДОБАВКИ . . . . . . . . . . . . . . . . 135
8.1.
8.2.
Составление сред . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Физико-химические свойства . . . . . . . . . 135
8.2.1. Значение pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Стр.7
Оглавление
7
Протокол 8.1. Приготовление стандартных
буферных растворов . . . . . . . . . . . 135
8.2.2. CO2 и бикарбонат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
8.2.3. Буферная система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
8.2.4. Кислород . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
8.2.5. Осмотическое давление . . . . . . . . . . . . . . . . 138
8.2.6. Температура . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
8.2.7. Вязкость . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
8.2.8. Поверхностное натяжение и пенообразование
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
Сбалансированные солевые растворы . 142
Полная среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
8.3.
8.4.
8.4.1. Аминокислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
8.4.2. Витамины . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
8.4.3. Соли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
8.4.4. Глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
8.4.5. Органические добавки . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
8.4.6. Гормоны и факторы роста . . . . . . . . . . . . . . 144
8.4.7. Антибиотики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
8.5.
Сыворотка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
8.5.1. Белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
8.5.2. Факторы роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
8.5.3. Гормоны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
8.5.4. Питательные вещества и метаболиты . . . . 146
8.5.5. Липиды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
8.5.6. Неорганические вещества . . . . . . . . . . . . . . 146
8.5.7. Ингибиторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
8.6.
Выбор среды и сыворотки . . . . . . . . . . . . 146
8.6.1. Резервирование партии сыворотки . . . . . . 147
8.6.2. Тестирование сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . 148
8.6.3. Термическая инактивация . . . . . . . . . . . . . . 149
8.7.
Другие добавки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
8.7.1. Гидролизаты аминокислот . . . . . . . . . . . . . 149
8.7.2. Эмбриональный экстракт . . . . . . . . . . . . . . 149
8.7.3. Кондиционированная среда . . . . . . . . . . . . 149
Глава 9 БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ . . . . . . . 150
9.1.
9.2.
Недостатки сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . 150
Преимущества бессывороточных сред . 154
9.2.1. Определение стандартной среды . . . . . . . . 154
9.2.2. Селективные среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
9.2.3. Регуляция пролиферации и дифференцировки
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
Недостатки бессывороточных сред . . . . 156
Замена сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
9.3.
9.4.
9.4.1. Коммерчески доступные бессывороточные
среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
9.4.2. Заменители сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . . 156
9.4.3. Бессывороточная субкультура . . . . . . . . . . 157
9.4.4. Гормоны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
9.4.5. Факторы роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
9.4.6. Питательные вещества сыворотки . . . . . . . 158
9.4.7. Белки и полиамины . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
9.4.8. Вязкость . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
9.5.
Выбор бессывороточной среды . . . . . . . . 158
9.5.1. Специфичность клеток или продукта . . . . 158
9.5.2. Адаптация клеток к бессывороточной
среде . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
9.6.
9.7.
9.8.
9.9.
Разработка бессывороточной среды . . . . 165
Приготовление бессывороточной среды 165
Среда, не содержащая животных белков
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
Глава 10 ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
10.1.
10.2.
10.3.
Приготовление реактивов и материалов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
Стерилизация оборудования и жидкостей
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
Оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
10.3.1. Стеклянная посуда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
Протокол 10.1. Подготовка и стерилизация
изделий из стекла . . . . . . . . . . . . . . 169
10.3.2. Стеклянные пипетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Протокол 10.2. Подготовка и стерилизация
стеклянных пипеток . . . . . . . . . . . . 173
10.3.3. Завинчивающиеся крышки . . . . . . . . . . . . . 175
Протокол 10.3. Подготовка и стерилизация
завинчивающихся крышек . . . . . . . . 175
10.3.4. Выбор детергента . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
10.3.5. Прочее оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
10.3.6. Стерилизационные фильтры многократного
использования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
Протокол 10.4. Стерилизация комплекта
фильтров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
Реагенты и среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
10.4.
10.4.1. Вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
Протокол 10.5. Приготовление и стерилизация
сверхчистой воды (UPW) . . . . . . 179
10.4.2. Техническое обслуживание водоочистительной
установки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
10.4.3. Сбалансированный солевой раствор (BSS) 180
Протокол 10.6. Приготовление и стерилизация
D-PBSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
10.4.4. Приготовление и стерилизация среды . . . . 181
Протокол 10.7. Приготовление
из концентрата с кратностью 1× . . . 182
Протокол 10.8. Приготовление
среды
среды
из концентрата с кратностью 10× . . 182
среды
из порошка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
10.4.6. Специализированная среда . . . . . . . . . . . . . 184
Протокол 10.10. Приготовление специализированной
среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
Стерилизация среды . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
10.5.
10.5.1. Автоклавируемые среды . . . . . . . . . . . . . . . 185
10.5.2. Стерилизация методом фильтрации . . . . . . 185
Протокол 10.11. Стерилизация с
использованием
фильтрующих насадок
на шприцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
Протокол 10.12. Стерилизация с использованием
фильтрующей вакуумной насадки
на колбу . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
10.4.5. Порошкообразные среды . . . . . . . . . . . . . . . 184
Протокол 10.9. Приготовление
Стр.8
8
Оглавление
Протокол 10.13. Стерилизация с использованием
малого встроенного фильтра . 189
Протокол 10.14. Стерилизационная фильтрация
с использованием большого прямоточного
фильтра . . . . . . . . . . . . . . . . 190
10.5.3. Сыворотка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
Протокол 10.15. Сбор и стерилизация сывороток
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
Протокол 10.16. Диализ сывороток . . . . . 194
10.5.4. Приготовление и стерилизация других реагентов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
10.6.
Контроль, проверка качества и хранение
сред . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
10.6.1. Контроль качества . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
10.6.2. Проверка стерильности . . . . . . . . . . . . . . . . 196
10.6.3. Проверка культуральных свойств . . . . . . . . 197
10.6.4. Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
Глава 11 ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА . . . . . . . . . . . . . 199
11.1.
Инициация первичной культуры клеток
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
11.1.1. Ферменты, используемые для дезагрегации
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
11.1.2. Общие характеристики дезагрегации . . . . 199
11.2.
Выделение образцов ткани . . . . . . . . . . . . 200
11.2.1. Мышиный эмбрион . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Протокол 11.1. Выделение мышиного эмбриона
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
11.2.2. Куриный эмбрион . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
Протокол 11.2. Выделение куриного эмбриона
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
11.2.3. Биопсийный материал человека . . . . . . . . . 204
Протокол 11.3. Передача и получение биопсийного
материала человека . . . . . . . 206
Типы первичной культуры . . . . . . . . . . . 206
11.3.
11.3.1. Первичный эксплантат . . . . . . . . . . . . . . . . 206
Протокол 11.4. Первичные эксплантаты . 206
11.3.2. Ферментативная дезагрегация . . . . . . . . . . 208
11.3.3. Теплый трипсин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Протокол 11.5. Дезагрегация ткани теплым
трипсином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
11.3.4. Трипсинизация с преинкубацией на холоде
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
Протокол 11.6. Дезагрегация ткани в холодном
трипсине . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
11.3.5. Рудиментарные органы куриного эмбриона
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
Протокол 11.7. Рудиментарные органы
куриного эмбриона . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
11.3.6. Дезагрегация с использованием других
ферментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
11.3.7. Коллагеназа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
Протокол 11.8. Дезагрегация ткани с помощью
коллагеназы . . . . . . . . . . . . . . . . 215
11.3.8. Механическая дезагрегация . . . . . . . . . . . . 219
Протокол 11.9. Механическая дезагрегация
ткани путем просеивания . . . . . . . 220
12.4.
11.3.9. Разделение жизнеспособных и нежизнеспособных
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
Протокол 11.10. Обогащение доли жизнеспособных
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
11.3.10. Первичная культура, краткие выводы . . . . 222
11.3.11. Первичная документация . . . . . . . . . . . . . . 222
Глава 12 СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ
ЛИНИИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
Субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
12.1.
12.1.1. Перекрестная контаминация и неправильная
идентификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
12.1.2. Микоплазменная контаминация . . . . . . . . . 227
12.1.3. Терминология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
12.1.4. Маркировка клеточной культуры . . . . . . . . 228
12.1.5. Возраст культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
12.2.
12.3.
Выбор клеточной линии . . . . . . . . . . . . . . 229
Обычный порядок поддержания культуры
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
12.3.1. Значение клеточной морфологии . . . . . . . . 230
12.3.2. Замена среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
12.3.3. Стандартный протокол замены среды . . . . 232
Протокол 12.1. Питание
культуры во флаконах . . . . . . . . . . . . . . 232
Протокол 12.2. Питание
монослойной
монослойной
культуры в чашках и планшетах . . . . . 233
Субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
12.4.1. Критерии субкультивирования . . . . . . . . . . 234
12.4.2. Стандартный протокол субкультивирования
клеток, образующих монослой . . . . . . . . . . 236
Протокол 12.3. Субкультивирование клеток,
образующих монослой . . . . . . . . . . 236
12.4.3. Цикл роста и индекс разведения . . . . . . . . 238
12.4.4. Концентрация клеток в субкультуре . . . . . 239
12.4.5. Размножение в суспензии . . . . . . . . . . . . . . 239
12.4.6. Субкультивирование клеток, растущих в суспензии
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
Протокол 12.4. Суспензионное субкультивирование
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
12.4.7. Стандартизация условий культивирования 241
12.4.8. Использование антибиотиков . . . . . . . . . . . 242
12.4.9. Ведение документации . . . . . . . . . . . . . . . . 242
Глава 13 КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ . . . . . 244
13.1.
13.2.
Клонирование клеток . . . . . . . . . . . . . . . . 244
Протокол 13.1. Клонирование с разведением
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
Стимуляция эффективности посева . . . 247
13.2.1. Условия, которые улучшают клональный
рост . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
13.2.2. Кондиционированные среды . . . . . . . . . . . . 249
Протокол 13.2. Приготовление кондиционированной
среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
13.2.3. Фидерные слои . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
Протокол 13.3. Приготовление фидерных
слоев . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
Суспензионное клонирование . . . . . . . . . 251
13.3.
Стр.9
Оглавление
9
Протокол 13.4. Клонирование в агаре . . . . 251
Протокол 13.5. Клонирование в Methocel . 252
13.4.
Выделение клонов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
Протокол 13.6. Выделение клонов с использованием
колец для клонирования . . . . . 255
Протокол 13.7. Выделение клеточных колоний
путем облучения . . . . . . . . . . . . . 257
13.4.1. Другие методы выделения монослойных
клонов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
13.4.2. Суспензионные клоны . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
Протокол 13.8. Выделение
суспензион13.5.
13.6.
13.7.
13.8.
ных
клонов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
Получение репликативных колоний . . . 258
Селективные ингибиторы . . . . . . . . . . . . 259
Выделение генетических вариантов . . . 259
Протокол 13.9. Метотрексат-резистентность
и DHFR-амплификация . . . . . . . . 259
Взаимодействие с субстратом . . . . . . . . . 261
13.8.1. Селективная адгезия . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
13.8.2. Селективное открепление . . . . . . . . . . . . . . 261
13.8.3. Природа субстрата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
13.8.4. Селективные фидерные слои . . . . . . . . . . . 261
13.8.5. Селекция на полужидкой среде . . . . . . . . . 261
Глава 14 РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . 263
14.1.
Плотность клеток и изопикническая седиментация
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Протокол 14.1. Разделение клеток центрифугированием
в градиенте плотности 263
14.2.
Размер клеток и скорость седиментации
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266
14.2.1. Гравитационная седиментация . . . . . . . . . . 266
14.2.2. Элютриация центрифугированием . . . . . . . 266
14.3. Методы, основанные на применении антител
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266
14.3.1. Иммунный пэннинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267
14.3.2. Магнитный сортинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
Протокол 14.2. Магнитно-активированный
клеточный сортинг (MACS) . . . . . . . . . 269
14.4. Флуоресцентно-активируемый клеточный
сортинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
Другие методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272
14.5.
14.6.
Подходы для начинающих к освоению
клеточного сортинга . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
Глава 15 ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК . . . . . . . . 274
15.1.
15.2.
15.3.
Необходимость характеристики . . . . . . . 274
Аутентификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274
15.4.
Ведение документации и происхождение
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275
Параметры характеристики . . . . . . . . . . 275
15.4.1. Видовая идентификация . . . . . . . . . . . . . . . 275
15.4.2. Происхождение тканевых маркеров . . . . . . 276
15.4.3. Уникальные маркеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277
15.4.4. Трансформация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278
15.5. Морфология клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278
15.5.1. Микроскопия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284
Протокол 15.1. Использование инвертированного
микроскопа . . . . . . . . . . . . . . . . 284
15.5.2. Окрашивание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285
Протокол 15.2. Окрашивание по Гимзе . . . 285
Протокол 15.3. Окрашивание кристаллвиолетом
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
15.5.3. Культуральные сосуды для цитологии: монослойные
культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
15.5.4. Приготовление суспензионной культуры для
цитологии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
Протокол 15.4. Подготовка суспензионной
культуры клеток для цитологических
исследований методом цитоцентрифугирования
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287
Протокол 15.5. Фильтрационная цитология
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
15.5.5. Микрофотография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
Протокол 15.6. Цифровая фотография
на микроскопе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
Конфокальная микроскопия . . . . . . . . . . 289
15.6.
15.7.
Хромосомный состав . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
Протокол 15.7. Приготовление хромосомного
препарата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
15.7.1. Дифференциальное окрашивание хромосом
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292
15.7.2. Хромосомный анализ . . . . . . . . . . . . . . . . . 293
15.8.
Анализ ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293
15.8.1. Гибридизация ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293
15.8.2. Фингерпринтинг ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . 293
15.8.3. Анализ профиля ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
Протокол 15.8. Анализ STR-профиля ДНК
клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296
Рнк и экспрессия белка . . . . . . . . . . . . . . . 298
Активность ферментов . . . . . . . . . . . . . . . 298
15.9.
15.10.
15.10.1. Изоферменты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298
15.10.2. Изоферментный электрофорез с набором для
определения аутентичности Authentikit . . . 300
Протокол 15.9. Изоферментный анализ . . 300
Антигенные маркеры . . . . . . . . . . . . . . . . 303
15.11.
15.11.1. Иммунное окрашивание . . . . . . . . . . . . . . . 304
Протокол 15.10. Непрямая иммунофлуоресценция
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304
15.11.2. Иммунный анализ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
15.12.
Дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306
Глава 16 ДИФФЕРЕНЦИРОВКА . . . . . . . . . . . . . . . 307
16.1.
Экспрессия фенотипа in vivo . . . . . . . . . . 307
16.1.1. Дедифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
16.1.2. Линейная селекция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
16.2.
16.3.
16.4.
Стадии дифференцировки . . . . . . . . . . . . 307
Пролиферация и дифференцировка . . . . 308
16.5.
16.6.
16.7.
Коммитирование и линии дифференцировки
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308
Пластичность стволовых клеток . . . . . . 309
Маркеры дифференцировки . . . . . . . . . . 310
Индукция дифференцировки . . . . . . . . . . 311
16.7.1. Межклеточные взаимодействия . . . . . . . . . 311
Стр.10
10
Оглавление
16.7.2. Системные факторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313
16.7.3. Взаимодействия клетки с матриксом . . . . . 315
16.7.4. Полярность и форма клетки . . . . . . . . . . . . 316
16.7.5. Давление кислорода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316
16.8.
16.9.
Дифференцировка и злокачественность 317
Практические аспекты . . . . . . . . . . . . . . . 317
Глава 17 ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
17.1.
17.2.
17.3.
Роль в характеристике клеточных линий
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
Что такое трансформация? . . . . . . . . . . . 318
Генетическая нестабильность и гетерогенность
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
17.3.1. Генетическая нестабильность . . . . . . . . . . . 318
17.3.2. Хромосомные аберрации . . . . . . . . . . . . . . . 320
17.4.
Иммортализация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321
17.4.1. Контроль физиологического старения . . . . 322
17.4.2. Иммортализация с использованием вирусных
генов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322
17.4.3. Иммортализация человеческих фибробластов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
Протокол 17.1. Иммортализация фибробластов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324
17.4.4. Теломеразоиндуцированная иммортализация
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
Протокол 17.2. Иммортализация мезенхимальных
стволовых клеток человека
с помощью теломеразы . . . . . . . . . . . . . 327
17.4.5. Иммортализация лимфоцитов . . . . . . . . . . 329
17.4.6. Трансгенные мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
17.5.
Аберрантный контроль роста . . . . . . . . . 329
17.5.1. Независимость от прикрепления к субстрату
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
17.5.2. Контактное ингибирование . . . . . . . . . . . . . 330
Протокол 17.3. Ограничение клеточной
пролиферации плотностью суспензии . 330
17.5.3. Зависимость от сыворотки . . . . . . . . . . . . . 331
17.5.4. Онкогены . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332
17.6.
Туморогенность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332
17.6.1. Малигнизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332
17.6.2. Опухолевая трансплантация . . . . . . . . . . . . 333
17.6.3. Инвазивность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
17.6.4. Ангиогенез . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334
Протокол 17.4. Исследование ангиогенеза
in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335
17.6.5. Активатор плазминогена . . . . . . . . . . . . . . . 337
Глава 18 КОНТАМИНАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
18.1.
Источники контаминации . . . . . . . . . . . . 338
18.1.1. Техника работы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
18.1.2. Окружающая среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
18.1.3. Использование и обслуживание ламинарного
шкафа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
18.1.4. Инкубаторы с увлажнением . . . . . . . . . . . . 341
Протокол 18.1. Обработка инкубаторов . 341
18.1.5. Холодильные камеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342
18.1.6. Стерильные материалы . . . . . . . . . . . . . . . . 342
18.1.7. Доставленные клеточные линии и образцы
биопсии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342
18.1.8. Карантин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342
18.2.
18.3.
Виды микробной контаминации . . . . . . 342
Контроль контаминации . . . . . . . . . . . . . 342
18.3.1. Визуально определяемая микробная контаминация
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343
18.3.2. Микоплазмы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343
18.3.3. Флуоресцентное окрашивание микоплазм 345
Протокол 18.2. Выявление микоплазм методом
флуоресценции . . . . . . . . . . . . . . 345
18.3.4. Использование PCR для обнаружения микоплазм
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346
Протокол 18.3. Использование PCR для обнаружения
микоплазм . . . . . . . . . . . . . . 346
18.3.5. Альтернативные методы детекции микоплазм
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348
18.3.6. Сервисные службы по обнаружению микоплазм
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350
18.3.7. Вирусная контаминация . . . . . . . . . . . . . . . 350
18.4.
18.5.
Уничтожение контаминированных культур
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350
Устранение контаминации . . . . . . . . . . . . 350
18.5.1. Бактерии, грибы и дрожжи . . . . . . . . . . . . . 350
Протокол 18.4. Устранение микробной
контаминации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350
18.5.2. Устранение микоплазм . . . . . . . . . . . . . . . . 351
Протокол 18.5. Устранение микоплазменной
контаминации . . . . . . . . . . . . . . . . . 351
18.5.3. Устранение вирусной контаминации . . . . . 352
18.5.4. Персистирующая контаминация . . . . . . . . 352
18.6.
18.7.
Перекрестная контаминация . . . . . . . . . 354
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354
Глава 19 КРИОКОНСЕРВАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . 355
19.1.
19.2.
Предпосылки метода замораживания . . 355
Подготовка к криоконсервации . . . . . . . 355
19.2.1. Валидация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
19.2.2. Когда нужно замораживать . . . . . . . . . . . . . 356
19.3.
Принципы криоконсервации . . . . . . . . . 356
19.3.1. Теоретическое обоснование замораживания
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
19.3.2. Концентрация клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
19.3.3. Среда для замораживания . . . . . . . . . . . . . . 356
19.3.4. Скорость охлаждения . . . . . . . . . . . . . . . . . 357
19.3.5. Ампулы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
19.3.6. Криоморозильники . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
19.3.7. Замораживание культивируемых клеток . . 362
Протокол 19.1. Замораживание клеток . . 362
19.3.8. Протоколирование работы морозильника . 364
19.3.9. Размораживание хранившихся ампул . . . . 364
Протокол 19.2. Размораживание клеток . 364
19.3.10. Флаконы для замораживания . . . . . . . . . . . 367
19.4.
Витрификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367
19.4.1. Криоконсервация эмбриональных стволовых
клеток человека (hES) . . . . . . . . . . . . . 367
Протокол 19.3. Криоконсервация
hESклеток
путем витрификации . . . . . . . . 367
Стр.11
Оглавление
11
19.4.2. Размораживание hES-клеток . . . . . . . . . . . . 368
Протокол 19.4. Размораживание
hESклеток,
криоконсервированных путем
витрификации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368
19.5.
Дизайн и контроль замороженных запасов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
19.5.1. Инвентарный контроль морозильника . . . . 369
19.5.2. Периодическая замена запасов культур . . . 370
19.6.
19.7.
Банки клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370
Транспортировка клеточных культур . . 371
19.7.1. Замороженные ампулы . . . . . . . . . . . . . . . . 371
19.7.2. Живые культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
Глава 20 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ . . . . . . . 373
20.1.
Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
20.1.1. Гемоцитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
Протокол 20.1. Подсчет клеток при помощи
гемоцитометра . . . . . . . . . . . . . . 374
20.1.2. Электронный счетчик . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
Протокол 20.2. Электронный
подсчет
клеток на основе электрического сопротивления
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378
20.1.3. Окрашенные монослои . . . . . . . . . . . . . . . . 380
20.1.4. Проточная цитометрия . . . . . . . . . . . . . . . . 380
20.2.
20.3.
Вес клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
20.4.
Содержание ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382
Протокол 20.3. Оценка содержания ДНК
с использованием красителя Hoechst
33258 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382
Белок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382
20.4.1. Солюбилизация образца . . . . . . . . . . . . . . . 382
20.4.2. Метод исследования белка по Брэдфорду . 382
Протокол 20.4. Оценка содержания белка
методом Брэдфорда . . . . . . . . . . . . . . . . 382
Скорость синтеза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
20.5.
20.5.1. Синтез ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
Протокол 20.5. Оценка уровня синтеза ДНК
методом включения [3Н]-тимидиновой
метки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
20.5.2. Синтез белка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385
Протокол 20.6. Синтез белка . . . . . . . . . . . 385
20.6.
20.7.
Приготовление образцов для ферментного
и иммуноферментного анализа . . . 386
Цитометрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386
20.7.1. Мечение in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386
20.7.2. Проточная цитометрия . . . . . . . . . . . . . . . . 386
20.8.
Репликация образцов . . . . . . . . . . . . . . . . 386
20.8.1. Сбор данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387
20.8.2. Анализ данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387
20.9.
Клеточная пролиферация . . . . . . . . . . . . . 387
20.9.1. Разработка эксперимента . . . . . . . . . . . . . . 387
20.9.2. Цикл роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389
Протокол 20.7. Кривая роста монослоя
во флаконах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391
Протокол 20.8. Кривая роста монослоя
в многолуночном планшете . . . . . . . . . . 391
20.9.3. Анализ кривых роста монослоя . . . . . . . . . 392
20.9.4. Объем среды, концентрация и плотность
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393
20.9.5. Суспензионные культуры . . . . . . . . . . . . . . 394
Протокол 20.9. Кривая роста суспензионной
культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
20.9.6. Фазы цикла роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
20.9.7. Производные кривой роста . . . . . . . . . . . . . 395
20.10.
Эффективность культивирования . . . . . 396
Протокол 20.10. Определение эффективности
посева на чашки Петри . . . . . . . 397
20.10.1. Анализ формирования колоний . . . . . . . . . 399
20.10.2. Автоматический счетчик колоний . . . . . 399
20.11.
Индекс мечения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399
Протокол 20.11. Индекс мечения [3Н]-тими
ди ном . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400
20.11.1. Ростовая фракция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
Протокол 20.12. Определение фракции пролиферирующих
клеток . . . . . . . . . . . . . . 401
20.11.2. Митотический индекс . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
20.11.3. Индекс пролиферации . . . . . . . . . . . . . . . . 401
20.12.
Время клеточного цикла . . . . . . . . . . . . . 402
20.13. Миграция клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402
Глава 21 ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ . . . . . . . . . . . . . . . 403
21.1.
21.2.
Жизнеспособность, токсичность и выживаемость
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403
Ограничения in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . 404
21.2.1. Фармакокинетика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404
21.2.2. Метаболизм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404
21.2.3. Тканевой и системный ответы . . . . . . . . . . 404
21.3.
Характер исследований . . . . . . . . . . . . . . 404
21.3.1. Жизнеспособность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405
Протокол 21.1. Оценка жизнеспособности
методом отторжения красителя . . . . 405
Протокол 21.2. Оценка жизнеспособности
методом поглощения красителя . . . . . 405
21.3.2. Выживаемость . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
Протокол 21.3. Клоногенный анализ прикрепленных
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
21.3.3. Анализ, основанный на клеточной пролиферации
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410
21.3.4. Метаболический анализ цитотоксичности 410
21.3.5. Микротитрационный анализ . . . . . . . . . . . . 410
Протокол 21.4. Оценка цитотоксичности
при помощи МТТ-теста . . . . . . . . . . . . 411
21.3.6. Сравнительная оценка микротитрационного
и клоногенного анализа выживания . . . . . . 414
21.3.7. Взаимодействие лекарственных препаратов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415
21.4.
Применение исследования цитотоксичности
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415
22.4.1. Скрининг противораковых препаратов . . . 415
21.4.2. Прогностические исследования противоопухолевых
препаратов . . . . . . . . . . . . . . . . 415
21.4.3. Фармацевтическое тестирование . . . . . . . . 416
21.5.
Генотоксичность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
Стр.12
12
Оглавление
21.5.1. Анализ мутагенеза методом обмена сестринских
хроматид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
Протокол 21.5. Обмен сестринских хроматид
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
21.5.2. Канцерогенность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418
21.6.
Воспаление . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
Глава 22 КУЛЬТУРЫ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ
КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
22.1.
22.2.
Клеточные культуры специализированных
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
Эпителиальные клетки . . . . . . . . . . . . . . 422
22.2.1. Эпидермис . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
Протокол 22.1. Эпидермальные кератиноциты
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424
22.2.2. Роговица . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427
Протокол 22.2. Эпителиальные клетки
роговицы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427
22.2.3. Молочная железа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429
Протокол 22.3. Получение эпителиальных
клеток молочной железы из тканей,
отобранных при маммопластике . . . . . 429
22.2.4. Шейка матки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431
Протокол 22.4. Цервикальный эпителий . 431
22.2.5. Желудочно-кишечный тракт . . . . . . . . . . . . 433
Протокол 22.5. Выделение и культивирование
клеток крипт толстого кишечника
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433
22.2.6. Печень . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434
22.2.7. Первичная культура гепатоцитов . . . . . . . . 434
Протокол 22.6 А. Выделение гепатоцитов
крысы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435
22.2.8. Гепатоциты человека HepaRG . . . . . . . . . . 436
Протокол 22.6 Б. Очистка гепатоцитов человека
HepaRG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437
22.2.9. Поджелудочная железа . . . . . . . . . . . . . . . . 438
Протокол 22.7. Эпителий
поджелудочной
железы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438
22.2.10. Почка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439
Протокол 22.8. Эпителий почки . . . . . . . . 440
22.2.11. Бронхиальный и трахеальный эпителий . . 441
Протокол 22.9. Бронхиальный и трахеальный
эпителий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441
22.2.12. Эпителий ротовой полости . . . . . . . . . . . . . 442
Протокол 22.10. Кератиноциты ротовой
полости . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
22.2.13. Простата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443
Протокол 22.11. Эпителий простаты . . . 444
22.3. Мезенхимальные клетки . . . . . . . . . . . . . 445
22.3.1. Соединительная ткань . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
22.3.2. Жировая ткань . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
Протокол 22.12. Первичная культура адипоцитов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
22.3.3. Мышцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 447
Протокол 22.13. Выделение и культивирование
гладкомышечных клеток . . . . . . . 447
Протокол 22.14. Культура миобластов
взрослой скелетной мышцы . . . . . . . . . 448
Протокол 22.15. Культура
отдельного
мышечного волокна скелетной мышцы 450
22.3.4. Хрящи . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451
Протокол 22.16. Хондроциты на альгинатных
бусинах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451
22.3.5. Кости . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453
Протокол 22.17. Остеобласты . . . . . . . . . 454
22.3.6. Эндотелий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
Протокол 22.18. Выделение и культивирование
клеток сосудистого эндотелия . 455
Нейроэктодермальные клетки . . . . . . . . 459
22.4.
22.4.1. Нейроны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459
Протокол 22.19. Выделение и культивирование
тучных клеток мозжечка . . . . . . 459
22.4.2. Глиальные клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 460
Протокол 22.20. Первичная
культура
астроцитов человека . . . . . . . . . . . . . . . 461
Протокол 22.21. Обонятельные клетки . . 463
22.4.3. Эндокринные клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465
22.4.4. Меланоциты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465
Протокол 22.22. Культура меланоцитов . 466
Гематопоэтические клетки . . . . . . . . . . . . 467
Гонады . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
22.5.
22.6.
22.6.1. Яичники . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
22.6.2. Тестикулы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
Глава 23 СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ГАМЕТЫ И АМНИОЦИТЫ
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470
Стволовые клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470
23.1.
23.1.1. Эмбриональные стволовые клетки . . . . . . . 470
23.1.2. Происхождение эмбриональных стволовых
клеток мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470
Протокол 23.1. Получение и первичное
культивирование эмбриональных стволовых
клеток мыши . . . . . . . . . . . . . . . . 471
23.1.3. Субкультура и размножение эмбриональных
стволовых клеток мыши . . . . . . . . . . . . . . . 474
Протокол 23.2. Размножение
эмбриональных
стволовых клеточных линий
мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474
23.1.4. Первичная культура эмбриональных стволовых
клеток человека . . . . . . . . . . . . . . . . 476
Протокол 23.3. Получение эмбриональных
стволовых клеток человека . . . . . . . . . . 476
23.1.5. Пересадка hES-клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
Протокол 23.4. Пересадка hES-клеток . . . 477
23.1.6. Плюрипотентные стволовые клетки из эмбрионов
рыбы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 478
Протокол 23.5. Культуры клеток эмбриона
данио-рерио . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479
Половые клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481
Экстраэмбриональные клетки . . . . . . . . 481
23.2.
23.3.
23.3.1. Культура амниоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481
Протокол 23.6. Культура амниоцитов . . . 482
23.3.2. Неонатальные и ювенильные клетки . . . . . 485
23.3.3. Мультипотентные стволовые клетки взрослых
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485
23.3.4. MSC из костного мозга человека . . . . . . . . 486
Стр.13
Оглавление
13
Протокол 23.7. Получение MSC из костного
мозга человека . . . . . . . . . . . . . . . . 487
23.3.5. Индуцированные плюрипотентные стволовые
клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 488
Протокол 23.8. Перепрограммирование
человеческих дермальных фибробластов
для генерации плюрипотентных стволовых
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489
23.3.6. Долгоживущие культуры костного мозга
мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491
Протокол 23.9. Долгоживущие гематопоэтические
клеточные культуры из костного
мозга мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491
23.3.7. Долгоживущие культуры человеческих примитивных
гематопоэтических клеток . . . . 493
Протокол 23.10. Исследование инициирующих
долгоживущую культуру человеческих
клеток (LTC-IC) . . . . . . . . . . . . . . . 493
23.3.8. Исследование гематопоэтических колониеобразующих
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 496
Протокол 23.11. Исследование гематопоэтических
колониеобразующих клеток . 496
Глава 24 КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК . . 499
24.1.
24.2.
Проблемы культивирования опухолевых
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 499
Получение образцов . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500
24.2.1. Селекция репрезентативных клеток . . . . . . 500
24.2.2. Сохранение тканей замораживанием . . . . . 500
Протокол 24.1. Замораживание образцов
биопсии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500
Дезагрегация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501
Первичная культура . . . . . . . . . . . . . . . . . 501
24.3.
24.4.
24.5.
Селективная культура опухолевых клеток
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502
24.5.1. Селективные среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502
24.5.2. Конфлюэнтные фидерные слои . . . . . . . . . 502
Протокол 24.2. Рост на конфлюэнтных
фидерных слоях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503
24.5.3. Суспензионное клонирование . . . . . . . . . . 505
24.5.4. Ксенотрансплантаты . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505
24.6.
Размножение клеточных линий . . . . . . . 505
24.6.1. Субкультивирование первичной опухолевой
культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505
24.6.2. Постоянные клеточные линии . . . . . . . . . . 506
24.7.
Характеристика культур опухолевых клеток
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506
24.7.1. Гетерогенность опухолевых культур . . . . . 506
24.7.2. Гистотипическая культура . . . . . . . . . . . . . . 507
24.8.
Специфические опухолевые культуры . 507
24.8.1. Молочная железа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 507
Протокол 24.3. Культивирование клеток
опухоли молочной железы . . . . . . . . . . . 508
24.8.2. Легкое . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509
24.8.3. Желудок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509
24.8.4. Толстый кишечник . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509
Протокол 24.4. Культура колоректальных
опухолей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 510
24.8.5. Поджелудочная железа . . . . . . . . . . . . . . . . 512
24.8.6. Яичники . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512
24.8.7. Простата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513
24.8.8. Мочевой пузырь . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513
24.8.9. Кожа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513
24.8.10. Шейка матки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513
24.8.11. Глиома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
24.8.12. Нейробластома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
24.8.13. Сперматоцитома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
24.8.14. Лимфома и лейкемия . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
Протокол 24.5. Определение постоянных
клеточных линий лейкемии и лимфомы 515
Глава 25 ТРЕХМЕРНАЯ КУЛЬТУРА . . . . . . . . . . . 516
25.1. Межклеточное взаимодействие и фенотипическая
экспрессия . . . . . . . . . . . . . . . 516
25.1.1. Роль плотности клеточной суспензии . . . . 516
25.1.2. Реципрокные взаимодействия . . . . . . . . . . 516
25.1.3. Выбор моделей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 517
25.2.
Органная культура . . . . . . . . . . . . . . . . . . 517
25.2.1. Обмен питательных веществ и газов . . . . . 517
25.2.2. Структурная целостность . . . . . . . . . . . . . . 519
25.2.3. Рост и дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . 519
25.2.4. Ограничения метода органной культуры . . 519
25.2.5. Типы органных культур . . . . . . . . . . . . . . . . 520
Протокол 25.1. Органная культура . . . . . . 520
Гистотипическая культура . . . . . . . . . . . . 521
25.3.
25.3.1. Метод геля и губки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 521
25.3.2. Полые волокна . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522
25.3.3. Сфероиды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522
Протокол 25.2. 3D-культуры в сфероидах 523
25.3.4. Система вращающихся камер . . . . . . . . . . . 525
25.3.5. Иммобилизация живых клеток в альгинате
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 525
25.3.6. Фильтрационные вкладыши для лунок . . . 526
Протокол 25.3. Фильтрационные вкладыши
для лунок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 526
25.3.7. Культуры нейрональных агрегатов . . . . . . . 528
Протокол 25.4. Нейрональные агрегаты . 528
Органотипическая культура . . . . . . . . . . 529
25.4.
25.4.1. Тканевые эквиваленты . . . . . . . . . . . . . . . . . 529
25.4.2. Тканевая инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529
25.5.
Создание трехмерных изображений клеток
(3D-реконструкций) . . . . . . . . . . . . . . 531
Глава 26 УВЕЛИЧЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВА КЛЕТОК
И АВТОМАТИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . 532
26.1.
Увеличение производства суспензионных
культур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532
Протокол 26.1. Перемешивание 4-литровой
партии суспензионной культуры . . . . . 533
26.1.1. Постоянная культура . . . . . . . . . . . . . . . . . . 535
26.1.2. Масштаб и сложности . . . . . . . . . . . . . . . . . 536
26.1.3. Перемешивание и аэрация . . . . . . . . . . . . . 536
26.2.
Крупномасштабное производство монослойных
культур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 539
26.2.1. Мультиповерхностные культиваторы . . . . 539
Стр.14
14
Оглавление
Протокол 26.2. Система Nunc Cell
Factory . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 539
26.2.2. Роллерные культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542
Протокол 26.3. Культура в роллерных бутылях
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542
26.2.3. Микроносители . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544
Протокол 26.4. Микроносители . . . . . . . . . 544
26.2.4. Крупные микроносители . . . . . . . . . . . . . . . 546
26.2.5. Перфузионные монослойные культуры . . . 546
26.3.
26.4.
Управление процессом . . . . . . . . . . . . . . . 547
Автоматизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 549
26.4.1. Роботизированная система культуры клеток
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 550
26.4.2. Высокопроизводительный скрининг . . . . . 550
Глава 27 СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ . . . . . . . . . . 551
27.1. Методы подготовки и исследования лимфоцитов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551
27.1.1. Выделение по плотности . . . . . . . . . . . . . . . 551
Протокол 27.1. Подготовка препарата
лимфоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551
27.1.2. Бласттрансформация . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552
Протокол 27.2. РНА-стимуляция лимфоцитов
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552
27.2.
27.3.
27.4.
Авторадиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552
Протокол 27.3. Микроавторадиография . 554
Съемка в режиме замедленного времени
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 557
Протокол 27.4. Видеосъемка в режиме замедленного
времени . . . . . . . . . . . . . . . . 557
Синхронизация клеток . . . . . . . . . . . . . . . 559
27.4.1. Разделение клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 559
27.4.2. Блокирование пролиферации . . . . . . . . . . . 559
27.5.
Культуры клеток пойкилотермных животных
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 559
27.5.1. Клетки рыб . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560
27.5.2. Клетки насекомых . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560
Протокол 27.5. Культивирование клеток
насекомых . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560
27.6.
СЛИЯНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561
27.6.1. Клеточная гибридизация . . . . . . . . . . . . . . . 561
Протокол 27.6. Клеточная гибридизация . 561
27.6.2. Ядерный перенос . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563
27.7.
Продукция моноклональных антител . . 563
Протокол 27.7. Продукция моноклональных
антител . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564
Глава 28 ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ . . . . 567
28.1.
28.2.
Цели и задачи главы . . . . . . . . . . . . . . . . . 567
Навыки препаративных работ и обращения
с оборудованием . . . . . . . . . . . . . . . . . 567
Упражнение 1. Стерильное пипетирование
и перенос жидкостей . . . . . . . . . . . . . . . 569
Упражнение 2. Мытье и стерилизация
стеклянной посуды . . . . . . . . . . . . . . . . . 571
Упражнение 3. Приготовление и стерилизация
воды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572
28.5.
28.3.
Упражнение 4. Приготовление и стерилизация
фосфатного буферного раствора
Дульбекко (D-PBS) без Ca2+ и Mg2+
(D-PBSА) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573
Упражнение 5. Приготовление стандартных
рН-растворов . . . . . . . . . . . . . . . . . 574
Упражнение 6. Приготовление основной
питательной среды из порошка и стерилизация
методом фильтрования . . . 575
Основные методы работы с культурой
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577
Упражнение 7. Наблюдение за культурой
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577
Упражнение 8. Приготовление стерильной
питательной среды . . . . . . . . . . . . . . . . 579
Упражнение 9. Смена среды в монослойной
культуре . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 580
Упражнение 10. Приготовление полной
среды из концентрата 10× . . . . . . . . . . 582
Упражнение 11. Подсчет клеток с помощью
гемоцитометра и электронного
счетчика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 584
Упражнение 12. Субкультивирование клеток,
растущих в суспензии . . . . . . . . . . 587
Упражнение 13. Субкультивирование клеточных
линий, растущих в монослое . . 589
Упражнение 14. Окрашивание монослойной
клеточной культуры по Гимзе . . . . 591
Упражнение 15. Построение и анализ кривой
роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 592
28.4.
Упражнения повышенной сложности . . 595
Упражнение 16. Характеристика клеточных
линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595
Упражнение 17. Обнаружение микоплазм 596
Упражнение 18. Криоконсервация культивируемых
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 597
Упражнение 19. Первичная культура . . . . 600
Упражнение 20. Клонирование
клеток,
растущих в монослое . . . . . . . . . . . . . . . 604
Специализированные упражнения . . . . 606
Глава 29 РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ . . . . . . . . . . . . . . . 607
29.1.
Аномальный внешний вид клеток . . . . . 607
29.2. Медленный рост клеток . . . . . . . . . . . . . . 608
29.2.1. Проблемы, ограниченные вашими собственными
культурами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 608
29.2.2. Более общие проблемы. Проблемы, с которыми
столкнулись другие исследователи . 608
Среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 610
29.3.
29.3.1. Состав, приготовление и хранение . . . . . . . 610
29.3.2. Нестабильные реагенты . . . . . . . . . . . . . . . 612
29.3.3. Чистота компонентов среды . . . . . . . . . . . . 612
29.4.
29.5.
Субстраты и контейнеры . . . . . . . . . . . . . 613
Микробиологическая контаминация . . 614
29.5.1. Контаминация, ограниченная одним исследователем
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 614
29.5.2. Широко распространенная контаминация 616
Стр.15
Оглавление
15
29.5.3. Системы подачи воздуха и ламинарные
боксы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618
29.5.4. Специфическая контаминация . . . . . . . . . . 618
29.6.
Химическое загрязнение . . . . . . . . . . . . . . 619
29.6.1. Стекло . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 619
29.6.2. Пипетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 619
29.6.3. Система очистки воды . . . . . . . . . . . . . . . . . 620
29.6.4. Криоконсерванты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620
29.6.5. Порошки и аэрозоли . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620
29.7.
Первичная культура . . . . . . . . . . . . . . . . . 620
29.7.1. Недостаточное количество взятых клеток
в первичной культуре . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620
29.7.2. Неправильная селекция клеток . . . . . . . . . . 622
29.7.3. Контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622
29.8.
29.9.
Дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622
Питание культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623
29.9.1. Простые монослойные культуры . . . . . . . . 623
29.9.2. Клонирование клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623
29.10. Субкультура . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 624
29.10.1. Недостаточное количество взятых клеток
или медленный рост . . . . . . . . . . . . . . . . . . 624
29.10.2. Неравномерное развитие культуры . . . . . . 624
29.11.
Клонирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625
29.11.1. Слишком мало колоний в чашке . . . . . . . . . 625
29.11.2. Слишком много колоний в чашке . . . . . . . . 626
29.11.3. Неравномерное распределение . . . . . . . . . . 627
29.12. Перекрестная контаминация и неверная
идентификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 627
29.13. Криоконсервация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 628
29.13.1. Плохое восстановление . . . . . . . . . . . . . . . . 628
Приложение I
РАСЧЕТЫ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632
Приложение II
ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 640
Приложение III
КОМПАНИИ-ПОСТАВЩИКИ И ДРУГИЕ
РЕСУРСЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 664
Приложение IV
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ [по Schaeff er, 1990] 677
Приложение V
КОНТАМИНИРОВАННЫЕ ИЛИ НЕПРАВИЛЬНО
ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫЕ
КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ . . . . . . . . . . . . . . . 684
Приложение VI
ОСНОВНАЯ ЛИТЕРАТУРА . . . . . . . . . . . 707
Список литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 709
Предметный указатель . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 758
29.13.2. Измененный внешний вид после криоконсервации
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 629
29.13.3. Потеря ростовой культуры . . . . . . . . . . . . . 629
29.14. Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630
29.14.1. Гемоцитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630
29.14.2. Электронный счетчик с измерением сопротивления
в капилляре . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630
Глава 30 ЗАКЛЮЧЕНИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 631
Стр.16