Практическая онкология №1 2013

Стр.1

Стр.2

Стр.3

© Н.В. Чердынцева и соавт., 2013 г. ББК Р 56 ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ В ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ ФГБУ НИИ онкологии ОНКОЛОГИИ В 2012 ГОДУ СО РАМН, г. Томск Н.В. Чердынцева, Н.В. Литвяков, Е.В. Денисов Знаменательно, что именно в 2012 году молекулярными онкологами получены неоспоримые доказательства существования стволовых клеток опухоли Лауреатами Нобелевской премии 2012 года в области физиологии и медицины стали John Gurdon (Gurdon Institute, UK) и Shinya Yama naka (Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, USA, and Kyoto University, Japan) за до стижения в изучении стволовых клеток, а именно за «открытие возможности перепрог раммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные» [1]. 40 лет назад, в 1962 году, J. Gurdon провел успешные эксперимен ты по выращиванию головастика из клетки (икринки) шпорцевой лягушки, в которую вместо собственного разрушенного ядра было имплантировано ядро «взрослой» (дифферен цированной) клетки кишечника головастика. Этот результат показал возможность обрати мости дифференцировки и послужил началом эры клонирования. Больше трех десятилетий спустя, в 2007 году, S. Yamanaka удалось полу чить из дифференцированных фибробластов плюрипотентные стволовые клетки, изменив уровень экспрессии генов Oct3/4, Sox2, Klf4 и cMyc, а затем снова дифференцировать их в зрелые клетки различных тканей [39]. Это от крытие дало ученым инструмент регуляции стволовых и дифференцированных клеток. Одним из важнейших практически значимых эффектов работы Яманаки в этическом плане является то, что нет необходимости работать со стволовыми клетками, полученными из эмбрионов, так как они могут быть заменены индуцированными плюрипотентными стволо выми клетками. Важность этих исследований для онкологии связана с перспективой дока зательства возможности образования опухо левых стволовых клеток (ОСК) из соматичес ких, поиска маркеров ОСК и молекулярных мишеней для разработки методов их избира тельного уничтожения в опухолях. Также по Cеdric Blanpain Нобелевские лауреаты 2012 года в области физиологии и медицины: John В. Gurdon Shinya Yamanaka явилась практическая перспектива создания банка индуцированных плюри потентных стволовых клеток для онкологических больных с целью замес тительной терапии. Знаменательно, что именно в 2012 году молекулярными онкологами получе ны неоспоримые доказательства существования стволовых клеток опухоли. Пря мое подтверждение концепции ОСК явилось одним из самых значительных ус пехов фундаментальной онкологии в 2012 году. ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ • Т. 14, №1 – 2013 1

Стр.1

Н.В.Чердынцева, Н.В.Литвяков, Е.В.Денисов Раковые стволовые клетки Популярная гипотеза о том, что многие опухоли под держиваются стволовыми раковыми клетками, подобно тому, как обычные стволовые клетки строят нормальные ткани, до сего года подтверждалась лишь косвенными методами. Сортировка клеток по поверхностным марке рам и последующая имплантация разных их субпопуля ций мышам позволила выявить клетки, дающие начало новым опухолям, и именно они рассматривались как стволовые. Однако возможность изменения свойств и поведения клеток при трансплантации в новом микро окружении оставляла открытым вопрос о физиологиче ской судьбе этих клеток в «родном» микроокружении, и действительно ли эти клетки могут дать в нем начало новым опухолям. Cédric Blanpain (Université Libre de Bruxelles, Belgium), научным кредо которого является «увидеть, чтобы поверить», усовершенствовал генетичес кую технологию анализа гистогенеза (lineage tracing), что позволило выявить паттерн клеток, делящихся в ткани, то есть в условиях их естественного микроокружения, и наблюдать динамику процесса в микроскоп. За это ис следование C. Blanpain был включен в число 10 извест ных ученых, отмеченных журналом «Nature» за выдаю щиеся научные достижения в 2012 году. Предложенный им методический подход позволил непосредственно в ткани, в привычном физиологическом окружении, на блюдать возникновение опухолей из определенных по пуляций клеток, которые можно с уверенностью считать стволовыми опухолевыми клетками. Процесс формиро вания опухоли удалось проследить независимо трем груп пам ученых на разных моделях – опухолях мозга, кожи и кишки. Полученные результаты, более подробное опи сание которых приведено ниже, подтвердили, что неболь шая популяция стволовых клеток ответственна за рост опухоли, но справедливо ли это для других опухолей – пока судить рано. Однако уже сейчас можно говорить о возможном изменении парадигмы химиотерапии, когда для оценки эффективности химиотерапии важно будет знать не столько уменьшение объема опухоли, а то, на сколько лекарственное средство воздействует на «при чинную» популяцию (клон) клеток – стволовых клеток, способных возобновлять рост опухоли после лечения [5]. Направленное токсическое воздействие на стволовые клетки опухоли может стать той «волшебной пулей», ко торая позволит уничтожить опухоль. Немного об истории вопроса В настоящее время существует две основных теории развития злокачественной опухоли. Согласно стохасти ческой (клональной) теории в опухолевые клетки могут трансформироваться любые соматические клетки, при этом все они являются потенциально клоногенными и могут давать начало новой опухоли, а опухолевая про грессия осуществляется в результате появления клонов, которые приобретают преимущество благодаря онкоген ным мутациям или эпигенетической модификации. По иерархической теории, опухоль развивается из ство 2 Practical oncology ловых клеток организма, и они, превращаясь в опухоле вые стволовые клетки, формируют ограниченную субпо пуляцию размножающихся клеток, которые и обеспечи вают рост и развитие опухоли. Каждая из теорий осно вывается на неоспоримых событиях опухолевого роста и имеет право на существование, более того, обе они под разумевают формирование клональных субпопуляций в пределах одного новообразования и могут дополнять друг друга. Стволовые клетки – это клетки различных органов и тканей, которые способны к асиммет ричному делению, при этом, одна из дочерних клеток остается стволовой, а другая дает на чало специализированным клеткам того или иного типа. Так происходят обновление и реге нерация тканей. Термин «стволовая клетка» был введен в науку в 1909 году российским ученым Александром Александровичем Максимовым (http://ru.wikipedia.org/wiki/) – так он назвал клетки крови, которые способны дать начало нескольким другим типам клеток. В 1960е годы была продемонстрирована возможность разви тия из клеток костного мозга клеток крови, а в 1981м году американский биолог Мартин Эванс впервые выделил из зародыша мыши плюрипо тентные стволовые клетки (способные разви ваться в клетки разного типа). В 1998 году аме риканским ученым Дж. Герхарту и Дж. Томпсону впервые удалось получить культуры эмбриональ ных стволовых клеток, способных развиваться в зрелые клетки различных типов. В 1999 году журнал Science признал открытие стволовых клеток третьим по значимости событием в биологии после открытия двойной спирали ДНК и программы «Геном человека». Опухолевые стволовые клетки дают начало иерархии идентичных родительским клеток, сохраняющих онко генный потенциал (самовоспроизведение), и клеток, ко торые «уходят» в дифференцировку, при этом последние могут иметь значительную фенотипическую и функцио нальную вариабельность, формируя внутриопухолевую гетерогенность. Впервые концепция опухолевых стволо вых клеток высказана в 1977 году для миелоидного лей коза и некоторых нейробластом [18]. Методом лимити рующих разведений культур опухолевых клеток при трансплантации была показана редкая субпопуляция кле ток острого миелобластного лейкоза, не более 0,011% от общего числа опухолевых клеток, которая могла ин дуцировать лейкемию у иммунодефицитных мышей. Впоследствии опухолевые стволовые клетки были най дены во многих солидных опухолях животных и челове ка [43]. Доля стволовых клеток в солидных опухолях мо жет сильно варьировать, отражая их биологическое и функциональное разнообразие, а также злокачественный потенциал опухоли [21]. В частности, распределение ОСК ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ • Т. 14, №1 – 2013

Стр.2

Practical oncology в опухоли молочной железы связано с ее молекулярным подтипом – наибольшая частота отмечается при «триж ды негативном» подтипе, который имеет неблагоприят ный прогноз [8, 26]. Метаанализ 12 исследований пока зал, что уровень CD133+ ОСК в опухоли может быть пер спективным прогностическим фактором при колорек тальном раке [45]. При повышенной частоте ОСК опухо ли хуже отвечают на химио и лучевую терапию, а сами стволовые клетки оказываются химиорезистентными, так как находятся в состоянии покоя (не пролиферируют), и в них высоко экспрессированы гены множественной ле карственной устойчивости. Кроме того, ОСК могут пре терпевать адаптивные изменения и в процессе лекар ственной терапии, усиливая устойчивость к химиопре паратам. Таким образом, жизнеспособность концепции опухолевых стволовых клеток подтверждается ее клини ческой пользой. В настоящее время активно разрабаты ваются таргетные препараты, направленные непосред ственно на ОСК [7, 17, 43]. Прямые доказательства существования опухолевых стволовых клеток В работе коллектива С. Blanpain изучалось развитие индуцированных (канцерогеном ДМБА – диметилбен(а) антраценом и промотором TPA) плоскоклеточных кар цином кожи мышей [11]. Чтобы иметь возможность на блюдать поведение индивидуальных клеток, их марки ровали особым образом. Мышам трансфецировали ге нетическую конструкцию К14CREER/RosaYFP, которая активируется при введении тамоксифена, и при этом эк спрессируется флуоресцирующий белок YFP (yellow fluorescent protein). Стволовые клетки кожи и их потом ки у этих мышей, при введении тамоксифена, продуци ровали белок YFP и флуоресцировали под действием уль трафиолета желтым светом. Изучив в динамике развитие плоскоклеточной карциномы, исследователи установи ли, что папилломы, образующиеся на первом этапе кан церогенеза, состоят из потомков стволовых клеток кожи. При дальнейшей трансформации папилломы в плоско клеточную карциному стволовые клетки, повидимому, уже опухолевые стволовые клетки, начинают бесконт рольно и активно делиться, и некоторые участки опухо ли составляют потомки однойединственной стволовой клетки. Таким образом, в данной работе напрямую было показано, что образование папиллом и плоскоклеточных карцином происходит за счет стволовых клеток. Группой исследователей под руководством проф. Luis Parada (University of Texas Southwestern Medical Center, USA) была выдвинута рабочая гипотеза, предполагавшая, что нейральные стволовые клетки, из которых образо вались опухолевые стволовые клетки, являются родона чальниками мультиформной глиомы [6]. Исследователи получили генетически трансформированную линию мышей, у которых развивались спонтанные глиомы, и нейральные стволовые клетки этих мышей были марки рованы двумя способами. Вопервых, они экспрессиро Н.В.Чердынцева, Н.В.Литвяков, Е.В.Денисов вали флуоресцентный белок GFP (Нобелевская премия по химии 2008 г. за открытие и изучение зеленого флуо ресцентного белка медузы Aequorea victoria (green fluorescent protein, GFP)), который позволял с помощью флуоресцентного микроскопа отличать их от других кле ток. Вовторых, они могли быть селективно убиты при помощи лекарства от герпеса – ганцикловира, посколь ку экспрессировали ген тимидинкиназы вируса просто го герпеса, при этом ганцикловир был совершенно без вреден для других клеток, как здоровых, так и опухоле вых. Исследователи выяснили, что при развитии глиомы только небольшое количество клеток в опухоли светит ся зеленым, т.е. в опухоли есть стволовые клетки и они родственны нейральным стволовым клеткам. Мышам провели химиотерапию препаратом темодал, который обладает селективностью в отношении пролиферирую щих клеток. После химиотерапии оказалось, что часть опухолевых клеток выжила, и опухоль снова начала рас ти. Выжившими клетками были светящиеся зеленым ство ловые клетки опухоли, они начали активно размножать ся и восстанавливать объем опухоли, при этом хорошо была заметна асимметричность деления стволовых кле ток – половина их дочерних клеток уже не светилась зе леным, т.е. не была стволовыми и подвергалась опреде ленной дифференцировке. Тем не менее, для того чтобы однозначно доказать роль стволовых клеток в развитии глиомы, нужно было продемонстрировать, что в отсут ствие фактора нет и изменений, которые он вызывает. Исследователи при помощи ганцикловира убили ней ральные стволовые клетки у мышей еще в молодом воз расте, и у этих мышей злокачественные глиомы в про цессе онтогенеза не развивались. Это достаточно четко свидетельствует о том, что нейральные стволовые клет ки являются родоначальниками развития злокачествен ной глиомы, и подтверждает рабочую гипотезу ученых. Третья группа исследователей (University Medical Center Utrecht, Netherlands) выполнила изящную работу на мо дели кишечной аденомы, которая развивается у мутант ных мышей [32]. Для маркировки клеток использовали многоцветный CRE (cAMP response element) репортер R26RConfetti, который позволяет выявить стволовые клетки слизистой кишечника. После введения тамокси фена они и их потомки светятся одним из четырех цве тов: красным, синим, зеленым или желтым. Через 24 дня исследователи второй раз ввели животным тамоксифен. После второго введения тамоксифена делящиеся ство ловые клетки (только делящиеся) и их новые потомки перекрашивались в другой цвет: если клетка при первом введении была красной, то после второго введения она становилась синей и наоборот, а если была зеленой, то становилась желтой и наоборот. Через 2 дня после вто рого введения тамоксифена исследователи увидели (рис. 1а), что практически все клетки опухоли – одного цвета, т.е. опухоль составили потомки одной группы клеток (ко торые окрасились изначально в один цвет). Небольшая группа клеток через 2 дня после второй инъекции тамок ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ • Т. 14, №1 – 2013 3

Стр.3