3·2013
Квартальный
научно-теоретический журнал
Основан в январе 1983 г.
РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ:
Главный редактор С. В. КОСТРОВ
Зам. главного редактора Ю. М. РОМАНОВА
Ответственный секретарь Т. С. ИЛЬИНА
В. И. АГОЛ, А. Д. АЛЬТШТЕЙН, А. П. АНИСИМОВ, В. А. ГВОЗДЕВ,
В. Н. ГЕРШАНОВИЧ,
А.Л. ГИНЦБУРГ, В. В. ДЕМКИН, Н. В. КАВЕРИН, Е. Д. КУЗНЕЦОВА (научный
редактор), С. А. ЛИМБОРСКАЯ, С. А. ЛУКЬЯНОВ, Н. Ф. МЯСОЕДОВ,
С. В. НЕТЕСОВ, Е. Д. СВЕРДЛОВ, Г. Б. СМИРНОВ, Н. И. СМИРНОВА,
В. З. ТАРАНТУЛ
РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ:
А. М. БОРОНИН (Пущино-на-Оке), В. И. ВОТЯКОВ (Минск), А. А. ПРОЗОРОВ
(Москва), Н. В. ТОМИЛИН (Санкт-Петербург), Ю. К. ФОМИЧЕВ (Минск),
С. В. ШЕСТАКОВ (Москва)
Журнал утвержден в Перечне ведущих научных журналов и изданий, выпускаемых в Российской
Федерации, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций
на соискание ученой степени доктора наук (Бюллетень ВАК)
Журнал полностью переводится на английский язык в США издательством ALLERTON PRESS, INC.
МОСКВА «ИЗДАТЕЛЬСТВО "МЕДИЦИНА"»
Стр.1
СОДЕРжАНИЕ
ОбзОРЫ
Дентовская С.В., Копылов П.Х., Иванов С.А., Агеев
С.А., Анисимов А.П. Молекулярные основы вакцинопрофилактики
чумы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Бондаренко Т.Ю., Терновой В.А., Нетесов С.В. Вирус
гепатита А: структурно-функциональная организация
генома, молекулярная диагностика и культивирование
........................................
ЭКСпЕРИМЕНТАЛьНЫЕ СТАТьИ
Кормилицына М.И., Мещерякова И.С., Михайлова Т.В.
Молекулярно-генетическая характеристика штаммов
Francisella tularensis, различающихся по таксономической
принадлежности и вирулентности .........
Салина Т.Ю., Морозова Т.И. Молекулярно-генетический
анализ изониазид-резистентных штаммов M. tuberculosis,
циркулирующих на территории Саратовской
области ......................................
Петрова И.Д., Кононова Ю.В., Чаусов Е.В., Шестопалов
А.М., Тишкова Ф.Х. Генетические варианты
вируса крымской-конго геморрагической лихорадки,
циркулировавшие в 2009 г. в эндемичных районах
южного Таджикистана . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bagheri R., Rabbani B., Mahdieh N., Khanahmad H.,
Abachi M., Asgari S. PCR-ELISA: a diagnostic assay
for identifying Iranian HIV seropositives ............
22
26
29
36
3
12
CONTENTS
REVIEWS
Dentovskaya S. V., Kopylov P. Kh., Ivanov S. A., Ageev
S. A., and Anisimov A. P. A Molecular Basis of the
Plague Vaccine Development
Bondarenko T. Yu., Ternovoi V. A., and Netesov S. V.
The Hepatitis A Virus: Structural and Functional Organization
of the Genome, Its Molecular Diagnostic
Value and Cultivation
ExpErimEntal Works
Kormilitsyna M. I., Meshcheryakova I. S., and
Mikhailova T. V. The Molecular and Genetic Characterization
of Francisella Tularensis Strains of Different
Taxonomic Status and Virulence
Salina T. Yu. and Morozova T. I. Molecular Genetic
Analysis of the Isoniazid-resistant Strains of M. tuberculosis
Circulating over the Saratov Region
Petrova I. D., Kononova Y. V., Chausov E. V., Shestopalov
A. M., and Tishkova F. H. Genetic Variants of
the Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Circulating
in Endemic Areas of the Southern Tajikistan in
2009
Bagheri R., Rabbani B., Mahdieh N., Khanahmad H.,
Abachi M., and Asgari S. PCR-ELISA: a Diagnostic
Assay for Identifying Iranian HIV Seropositives
Адрес редакции:
Москва, 107140
ул. Верхняя Красносельская, д. 17А, стр. 1 Б
ОАО «Издательство "Медицина"»
Редакция журнала "Молекулярная генетика, микробиология и вирусология"
Тел. редакции: (499) 264-36-66
e-mail: molgenetica@yandex.ru
Зав. редакцией И. Х. Измайлова
ОТДЕЛ РЕКЛАМЫ
Тел./факс 8-499-264-00-90
E-mail: oao-meditsina@mail.ru
Ответственность
за достоверность информации,
содержащейся в рекламных
материалах, несут
рекламодатели.
Редактор Е. И. Константинова
Художественный редактор
А. В. Минаичев
Корректор Л. В. Кузнецова
Переводчик С. К. Чаморовский
Все пpава защищены. Ни одна часть этого
издания не может быть занесена в память
компьютеpа либо воспpоизведена любым
способом без пpедваpительного письменного
pазpешения издателя.
Сдано в набор 17.04.13
Подписано в печать 30.05.13
Формат 60 Ч 88⅛.
Печать офсетная. Печ. л. 5,00.
Усл.-печ. л. 4,90. Уч.-изд. л. 5,50.
Заказ 251.
Подписной тираж номера 191 экз.
ЛР №010215 от 29.04.97 г.
E-mail: meditsina@mtu-net.ru
www.medlit.ru
Отпечатано в типографии ООО "Подольская
Периодика",
142110, г. Подольск, ул. Кирова, 15
© ОАО «Издательство "Медицина"», 2013
2
Стр.2
ОБЗОРы
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 615.371:579.842.23.035.4.012.6:577.21.08
С. В. Дентовская, П. Х. Копылов, С. А. Иванов, С. А. Агеев, А. П. Анисимов
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ВАКЦИНОпРОФИЛАКТИКИ ЧУМЫ
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск, Московская обл.
В обзоре освещены молекулярные механизмы патогенеза и особенности
формирования специфического иммунитета при чуме.
Описаны история и современное состояние вакцинопрофилактики
инфекции. Особое внимание уделено перспективам в области
разработки противочумных вакцин, рассмотрены возможные
пути совершенствования вакцинных препаратов.
К л ю ч е в ы е с л о в а : Yersinia pestis, патогенез, иммунитет,
вакцинопрофилактика.
Введение
Чума – наиболее опасная из бактериальных инфекций.
«Юстинианова чума» (531–580 гг. н. э.), "черная
смерть" (1347–1407 гг. н. э.) и третья пандемия чумы
(1894 г. – настояшее время), унесшие более 200 млн
человеческих жизней [112], были вызваны возбудителем
чумы [54]. Эпидемии чумы нередко приводили к
падению государств и разрушению древних цивилизаций.
В отдельных странах погибало до 90 % населения
[14, 66, 112].
Чистую культуру чумного микроба Yersinia pestis
выделил A. Yersin в 1894 г. во время эпидемии чумы в
Гонконге [158]. Этот микроорганизм относится к роду
Yersinia семейства Enterobacteriacea, который в настоящее
время включает 17 видов [79, 103, 104]. Два других
патогенных для человека вида – Y. pseudotuberculosis и
Y. enterocolitica – вызывают передающиеся алиментарным
путем кишечные заболевания, как правило, легкой
или средней тяжести со склонностью к подострому течению.
Заболевание, вызываемое Y. pestis, значительно
отличается от псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза
по эпидемиологическим особенностям и патогенезу.
Основными путями распространения Y. pestis
являются передача инфицированными блохами и аэрогенный.
При отсутствии лечения летальность при бубонной
форме чумы достигает 60 %, а при септической
и легочной – 100%. От момента заражения до гибели
чувствительного к чуме теплокровного животного проходит,
как правило, не более 1 нед [43, 112].
Молекулярные механизмы патогенеза чумы
Бактерии Y. pestis [158] для постоянной циркуляции
в экосистемах природных очагов чумы должны
проникнуть в организм хозяина, успешно противостоять
врожденному иммунитету грызуна и размножиться
для индуцирования бактериемии, необходимой
для дальнейшей передачи блохами новому хозяину
[76, 155]. Каждый из этих этапов циклического
существования обеспечивается множеством факторов
патогенности и генов "домашнего хозяйства" Y. pestis,
которые могут действовать совместно или индивидуально.
Каждый из этих факторов в свою очередь может
участвовать в различных стадиях инфекционного
процесса или передачи патогена. Биомолекулы и ор3
ганеллы
микроорганизма, обеспечивающие патогенез
инфекции, принято относить к факторам патогенности
[2, 3, 31, 33].
В середине прошлого века T. Burrows [47–49]
37 °С от наличия в среде ионов Са2+
W-антигенов, "мышиного" токсина (Tox+
ного антигена FI (Fra+
пестицина (Pst+
гулазы (Cg+
), фибринолизина (Fb+
синтезировать эндогенные пурины (Pur+
определил набор признаков, присутствующий у всех
изученных им вирулентных штаммов Y. pestis, – классические
"детерминанты вирулентности". К их числу
он относил способность клеток сорбировать экзогенные
красители и гемин (Pgm+
), зависимость роста при
(Ca),
синтез V- и
) и капсульили
F1), сочетанный синтез
) и плазмокоа),
пуринонезависимость или способность
). После пяти
десятилетий исследований и дискуссий, прошедших
с момента постулирования "детерминант вирулентности",
некоторые из них, такие как W-антиген, пестицин
и способность к синтезу эндогенных пуринов в
настоящее время уже не рассматривают как факторы
патогенности [2, 31, 112].
Основной фактор патогенности иерсиний – это
комплекс свойств, кодируемых плазмидой pCad, обязательной
для проявления вирулентности возбудителем
чумы. Этот комплекс признаков – вирулон Yop
– система, позволяющая внеклеточно расположенным
бактериям обезвреживать клетки, участвующие
в иммунном ответе хозяина, разрушающая их связи
и вызывающая апоптоз путем инъекции бактериальных
эффекторных протеинов. Эта система состоит
из белков Yop и аппарата их секреции 3-го типа, названного
Ysc. Аппарат Ysc состоит из 25 белков. По
своим функциям большая часть Yop-белков может
быть разделена на 2 группы. Часть из них является
внутриклеточными эффекторами (YopE, YopH, YpkA/YopO,
YopP/YopJ, YopM, YopT), тогда как другие
(YopB, YopD, LcrV) формируют аппарат транслокации,
который разворачивается на поверхности бактерии
для доставки эффекторов через плазматическую
мембрану внутрь эукариотических клеток. Секреция
Yop-белков запускается при контакте с эукариотическими
клетками и контролируется белками вирулона,
включая YopN, TyeA, LcrG, которые закрывают бактериальный
секреторный канал предположительно в
виде затвора. Для точного функционирования системы
необходимы также шапероны, названные белками
Syc, которые находятся в бактериальном цитозоле.
Транскрипция генов контролируется температурой
и активностью аппарата секреции [147]. В последние
годы выявлен ряд новых факторов патогенности,
часть из которых наряду с классическими представлена
в таблице.
Стр.3
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №3, 2013
Некоторые факторы, обеспечивающие жизнедеятельность Y. pestis в организме теплокровного хозяина (модифицировано из статьи
[31] с учетом материалов [32, 41, 57, 67, 129, 142, 160])
Фактор
Стимулон, кодируемый плазмидой pCad,
и реагирующий на низкую концентрацию
Ca2+
(low-calcium response - LCR) и включающий
ассоциированную с вирулентностью
бактерии систему секреции III типа
(type III secretion system – T3SS), а также
эффекторные белки внешних мембран
иерсиний (Yersinia outer membrane proteins
– Yop), а именно:
V антиген (LcrV)
Функция или активность
Факторы патогенности
Система, позволяющая внеклеточно расположенным иерсиниям противостоять
неспецифическому иммунному ответу за счет противодействия
фагоцитозу, сигнальной активности макрофагов и индукции апоптоза
фагоцитарных клеток (доставка токсических бактериальных Yop белков
из внеклеточно расположенных бактерий в цитозоль эукариотической
клетки)
Транслокация Yop белков; ингибиция хемотаксиса нейтрофилов; супрессия
синтеза γ-интерферона и фактора некроза опухолей α-цитокинов, необходимых
для неспецифической активации профессиональных фагоцитов и образования
продуктивных гранулем, за счет опосредованной взаимодействием
с Толл-подобным рецептором 2 (TLR2) стимуляции продукции ИЛ-10
репрессора указанных выше цитокинов; ингибиция индуцированной сахаридом
ЛПС продукции в макрофагах интерлейкина 1β
YopD
YopE
YopH
YopM
YopJ/YopP
YopT
YpkA/YopO
YscF
Активатор плазминогена (Pla) (кодируется
плазмидой pPst)
Транслокация Yop белков
Противодействие фагоцитозу; деполимеризация актина; инактивация
Rho-белков
Противодействие фагоцитозу; протеин-тирозин-фосфатаза; индуктор
апоптоза; ингибирование пролиферации лимфоцитов
Нарушение взаимодействия тромбина с тромбоцитами и препятствие
их агрегации, необходимой для формирования кровяных сгустков
Снижение воспалительного ответа макрофагов, эпителиальных и эндотелиальных
клеток за счет блокирования активации митогенактивированной
протеинкиназы и ядерного фактора κB
Противодействие фагоцитозу; инактивация Rho-белков; деполимеризация
актиновых стрессовых волокон
Противодействие фагоцитозу; инактивация Rho-белков; аутофосфорилирующаяся
сериновая/треониновая киназа
Формирование внешней "иглы" T3SS; участие в секреции эффекторных
белков вирулентности, их транслокации через эукариотические мембраны,
прикреплении бактерии к эукариотической клетке и регуляция
работы T3SS в зависимости от концентрации Ca2+
Фактор распространения, обеспечивающий генерализацию инфекции;
протеаза, определяющая фибринолитическую (37 °С) и плазмокоагулазную
(28 С) активность чумного микроба; посттрансляционный гидролиз
Yop белков; гидролиз катионных антимикробных пептидов дыхательных
путей; адгезивная и инвазивная активность
Муреиновый липопротеин Брауна (Lpp) Совместно с ЛПС индуцирует эндотоксический шок
Липопротеин NlpD
pН6-антиген (PsaA)
Капсульный антиген "фракция I" (FI, F1;
Caf1) (кодируется плазмидой pFra)
Ail
"Мышиный токсин" (Tox, Ymt) (кодируется
плазмидой pFra)
ЛПС
Фактор распространения, обеспечивающий генерализацию инфекции
Противодействие фагоцитозу; адгезивная активность
Противодействие фагоцитозу; адгезивная активность; защита от катионных
антимикробных пептидов дыхательных путей
Адгезивная активность; устойчивость к бактерицидному действию
комплемента сыворотки
Развитие токсического шока (у мышей и крыс); потенцирование эндотоксического
шока у млекопитающих
Развитие эндотоксического шока; устойчивость к бактерицидному действию
антимикробных катионных пептидов и комплемента сыворотки;
адгезивная активность; обеспечение энзиматически активного фолдинга
молекулы Pla
Факторы, ответственные за питание бактерии, и гены "домашнего хозяйства"
Синтез и транспорт сидерофора –иерсиниабактина
Сорбция
гемина (hemin storage –Hms)
Ферменты биосинтеза пуринов
Dam
Двухкомпонентная регуляторная система
PhoP/Q
Сидерофорзависимая система транспорта в бактериальную клетку
железа
Сорбция гемина на поверхности бактериальных клеток
De novo синтез пуринов
Метилирование аденина ДНК
Активация устойчивости бактерий к факторам врожденного иммунитета
+
−
+
−
−
−
−
−
+
−
−
+
−
−
±
способностью
к транслокации в эукариотические клетки, на функционально полноценный гомолог YopP из Y. enterocolitica приводит к образованию
клеток чумного микроба, цитотоксичных в отношении макрофагов и снижающих вирулентность при подкожном заражении на 7 порядков;
*** – несколько знаков + или знак ± свидетельствуют о противоречивых данных, полученных различными группами исследователей.
Пр и м е ч а н и е . *Нд – нет данных; ** – замена в клетках Y. pestis собственного эффекторного белка YopJ, характеризующегося сниженной
4
+
−
−
Степень снижения
вирулентности у нокаутных
мутантов, lg
> 4
4–2
2–0
+
−
−
Нд* Нд
+
+
+
−/+**
Нд
Нд
Нд
+
−
−
−
−
Нд
Нд
Нд
+
Нд
−
−
−
+
Нд
Нд
Нд
+***
−
+
+
+
−
−
+
−
−
+
+
+
−
−
+
−
+
+
−
+
−
Стр.4
ОБЗОРы
Как было отмечено выше, возбудитель чумы цирном
и алиментарном заражении возрастают до 102
104
и 105
–109
кулирует в популяциях грызунов и/или лагоморфов и
передается через укусы паразитирующих на них блох
[17, 76, 155]. Менее 10 бактерий Y. pestis достаточно
для смертельной инфекции у грызунов и приматов
при внутрикожном, подкожном или внутривенном заражении
[3, 17, 31, 112]. Кроме того, возможно заражение
при поедании трупов/мяса погибших от чумы
животных [2, 17, 50, 112] и/или вдыхании аэрозолированных
выделений больных с легочной формой инфекции
[2, 17, 64, 112]. Величины LD50
при аэрозоль–
бактериальных
клеток соответственно
[3, 17, 33, 50, 56].
В зависимости от стадии существования в организме
пойкилотермной блохи или теплокровного млекопитающего
на Y. pestis действуют внешние сигналы,
прежде всего температура экологической ниши [2],
определяющие спектр экспрессирующихся в данный
момент генов и соответственно антигенный состав,
характерный для векторной и/или гостальной фазы
существования бактерии [72, 102]. Так, при температуре
21–28°С, свойственной условиям пребывания
Y. pestis в пищеварительном тракте блохи, в клетках
чумного микроба синтезируется гексаацильный липополисахарид
(ЛПС) с 6 жирнокислотными остатками
[86], являющийся мощным индуктором системы
врожденного иммунитета млекопитающих [12, 82] за
счет распознавания и связывания Toll-подобным рецептором
4 (Toll-like receptor 4, TLR4)–MD2–CD14
[100, 101].
Сразу после укуса инфицированной блохи и проникновения
Y. pestis в организм теплокровного хозяина
бактерии с гексаацильным ЛПС распознаются рецепторным
комплексом TLR4–MD2–CD14 [100, 101],
легко фагоцитируются и гибнут в нейтрофилах [52] (а
при первичной легочной чуме – в D11c+
дритных клетках (СD11c+
тах (Gr-1+
/CD11b),
а также в моноци)
[95]. Оказалось, что активатор плазминогена
Pla Y. pestis взаимодействует с используемым для
захвата и презентации антигенов лектиновым рецептором
типа C – DEC-205 (CD205), присутствующим на
поверхности макрофагов и дендритных клеток. Любые
нарушения образования комплекса Pla-DEC-205
снижали степень диссеминации клеток Y. pestis в организме
мышей [162]. Таким образом, повышенная
при температуре теплокровного хозяина продукция
и удельная активность активатора плазминогена Pla
[94] – основного фактора распространения чумного
микроба [132] – способствуют проникновению бактерий,
расположенных внутри антигенпрезентирующих
клеток хозяина, с током лимфы из места укуса
блохи в регионарные лимфатические узлы. Кроме
того, Pla, гидролизуя плазминоген хозяина, переводит
его в плазмин, результатом чего являются неконтролируемый
протеолиз и повреждение тканей макроорганизма,
способствующее дальнейшей диссеминации
Y. pestis [88, 89]. Проникнув в регионарный лимфатический
узел, микроб продолжает размножаться, вызывая
воспалительный процесс, захватывающий все
соседние лимфатические узлы и прилегающую к ним
подкожную клетчатку.
Для последующего этапа уже внеклеточной диссе-клетках
легких
[40]), но выживают и размножаются в макрофагах
[52]. Чумной микроб размножается в фаголизосомах
макрофагов [134], содержимое которых характеризуется
низкими значениями pH, а также значительным
содержанием реактивных форм кислорода и азота,
антимикробных пептидов и протеаз [115], вероятно,
за счет способности Y. pestis нейтрализовывать
низкие значения рН фаголизосомы [116]. Показано,
что Y. pestis способны ингибировать и продукцию
окиси азота [115]. Установлено, что для выживания
иерсиний в макрофагах необходимо функционирование
плейотропной регуляторной двухкомпонентной
системы грамотрицательных бактерий PhoP/PhoQ.
В экспериментах с использованием phoP-мутантов Y.
pestis in vitro показано, что система PhoP/PhoQ необходима
для существования в условиях низких значений
pH, оксидативного стресса и низкого содержания
Mg2+
[109]. Оказалось, что нокаутные мутанты Y. pestis
по гену phoP [77], регулирующему и оперон arn (pmrHFIJKLM),
отвечающий за присоединение катионного
моносахарида 4-амино-4-дезокси-L-арабинозы
(Ara4N) к фосфатным группам липида А ЛПС, или
по гену arnT (pmrК) [11, 85], кодирующему Ara4Nтрансферазу,
чувствительны к катионным антимикробным
пептидам.
Позднее было показано, что Y. pestis размножается
не только в макрофагах (СD11b+
/CD11c),
но и в ден5
tis
происходит синтез тетраацильного ЛПС [86], который
в отличие от гексаацильного не распознается
рецепторным комплексом TLR4–MD2–CD14 [101],
в результате клетки возбудителя чумы начинают уже
неконтролируемое организмом хозяина размножение
[52]. Если инфекционный процесс не останавливается
в стадии бубонной формы заболевания, развивается
вторичная септицемия, сопровождающаяся проникновением
чумного микроба в другие органы [31,
112].
При первичной септической форме заболевания
после укуса блохи бактерии сразу попадают в кровь,
минуя лимфатическую систему и проходя этап первоначального
размножения в макрофагах непосредственно
в кровяном русле [128]. Повышенный при
температуре 37°C и выше синтез непилевого адгезина
Ail из семейства Ail/Lom-белков внешних мемминации
возбудитель чумы должен противостоять таким
компонентам иммунной системы, как захват профессиональными
фагоцитами, секреция цитокинов и
комплементопосредованный лизиз бактерий. В ходе
размножения в макрофагах при температуре 37°C и
выше у Y. pestis начинает функционировать вирулон
Yop, а затем синтезируются F1- и pH6-антигены (см.
таблицу), обеспечивающие бактерии после выхода из
разрушенных макрофагов устойчивостью к поглощению
любыми типами фагоцитарных клеток [52, 55,
78, 147]. Синтез V-антигена угнетает врожденный
иммунитет за счет стимуляции синтеза интерлекина10
(ИЛ-10), противовоспалительного цитокина, подавляющего
синтез γ-интерферона и фактора некроза
опухоли α, участвующих в индукции воспалительного
процесса [45]. Было показано, что полное удаление
ИЛ-10 из организма лабораторных животных (в результате
мутации или применения моноклональных
антител к ИЛ-10), зараженных Y. pestis, приводило к
повышению устойчивости к заражению [113].
Кроме того, при температуре 37°C и выше у Y. pes
Стр.5