ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
СОВРЕМЕННЫЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Учебное пособие
Составители:
О. А. Сафонова
А. В. Семенихина
Т. И. Рахманова
Т. Н. Попова
И. Ю. Степанова
Издательско-полиграфический центр
Воронежского государственного университета
2009
Стр.1
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................5
1. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ
ДИАГНОСТИКЕ...................................................................................................6
1.1. Реакция агглютинации (РА)................................................................7
1.1.1. Ориентировочная РА для идентификации микроба ..............8
1.2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) ...................................8
1.3. Иммуноферментный анализ .............................................................10
1.3.1. Общие принципы метода гетерогенного ИФА.....................16
1.3.2. Динамика изменений показателей ИФА-тестов
при инфицировании..........................................................................19
2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ .............................................22
2.1. Выделение и анализ нуклеиновых кислот.......................................23
2.1.1. Качественный анализ..............................................................24
2.1.2. Количественный анализ нуклеиновых кислот .....................24
2.2. Некоторые ферменты, применяемые в молекулярной
диагностике ...............................................................................................25
2.2.1. Нуклеазы и их применение ....................................................25
2.2.2. Ингибиторы РНКаз и их практическое применение............25
2.2.3. Рестриктазы .............................................................................26
2.3. Гибридизационные методы ..............................................................26
2.3.1. Получение зондов ...................................................................29
2.3.2. Метод гибридизации в растворе............................................31
2.3.3. Метод гибридизации на твердом носителе...........................32
2.3.4. Гибридизация in situ................................................................32
2.3.5. Блот-гибридизация..................................................................35
2.3.6. Метод сэндвич-гибридизации................................................36
2.3.7. Метод разветвленной ДНК.....................................................37
2.4. Методы амплификации нуклеиновых кислот .................................37
2.4.1. Полимеразная цепная реакция...............................................38
2.4.2. Лигазная цепная реакция........................................................56
3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ..........................57
3.1. Метод ПЦР/ЛОЗ ................................................................................57
3.2. Методы первичной идентификации мутаций .................................58
3.2.1. Секвенирование ДНК .............................................................59
3.2.2. Метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой
ДНК (Single Strand Conformation Polymorphism – SSCP)........60
3
Стр.3
1. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью
и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми.
Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов,
оценки и мониторинга различных онкологических заболеваний, определения
специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных
микроорганизмов. Применение данных систем возможно при условии, что
анализируемый компонент обладает свойствами антигена (АГ), то есть способностью
вызывать в организме человека или животных синтез особых белков
– антител (АТ), с высокой специфичностью связывающих антиген.
В качестве антигена могут выступать клетки микроорганизмов, вирусы,
белки и полисахариды. Это полноценные антигены. Антитела образуются не
против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим
участкам на их поверхности – антигенным детерминантам (эпитопам). Такие
участки у белков включают не менее пяти аминокислотных остатков. Антигенные
детерминанты разветвленных молекул полисахаридов представлены
цепочками из четырех-шести остатков. Существуют также неполноценные антигены
– гаптены. Антитела к гаптенам образуются лишь при их посадке на
полимерную матрицу, в качестве которой используются белки, полимеры клеточных
стенок бактерий, синтетические полиэлектролиты. Таким способом
можно получить антитела к антибиотикам и другим лекарственным соединениям,
стероидным и пептидным гормонам, витаминам, пестицидам и т.д. Гаптены
представлены не только низкомолекулярными соединениями. Так, нуклеиновые
кислоты сами по себе неиммуногенны. Однако антитела к нуклеиновым
кислотам синтезируются, если они находятся в комплексе с белками.
Антигенные детерминанты нуклеиновых кислот – три- и тетрануклеотиды.
Выделение и очистка антигена для создания диагностикума – достаточно
трудоемкий процесс. В настоящее время данные задачи решаются с помощью
методов биотехнологии путем создания генноинженерных (трансгенных)
бактерий или дрожжей, синтезирующих антиген в необходимых количествах.
Иммунный ответ на введение одного антигена сопровождается синтезом
антител, различающихся по структуре и функциональному предназначению.
Это иммуноглобулины (Ig) классов G, D, E, A, M, из которых
первые три могут связать по две молекулы антигена, то есть двухвалентны,
IgA четырех- или восьмивалентны, IgM десятивалентны. С учетом того,
что антиген, используемый для иммунизации животного, содержит не одну,
а несколько антигенных детерминант, можно представить, какое множество
антител вырабатывается в организме на введение одного антигена.
Такие антитела называются поликлональными. Они гетерогенны по сродству
к антигенам. Их состав непостоянен и зависит от вида животного, его
генетических особенностей и физиологического состояния.
6
Стр.6
Антитела получают путем иммунизации животных соответствующим
антигеном: в лабораторных условиях это мыши, морские свинки, кролики,
на производстве – овцы, козы, лошади. Пригодны куры: антитела после
иммунизации выделяют из желтков яиц.
Для очистки и стандартизации поликлональных антител используется
аффинная хроматография. Сыворотка крови от иммунизированного животного
пропускается через колонку с полисахаридным носителем, к которому
ковалентно пришит антиген. Специфические антитела связываются
антигеном, все другие белки, и в том числе антитела с низким сродством к
антигену, проходят через колонку, вслед за этим специфически связанные
антитела смывают с колонки кислым или щелочным раствором: связь антигена
с антителом нековалентна. Один цикл аффинной хроматографии
позволяет очистить белки в 1000 раз и более.
Однако даже такой способ очистки не позволяет полностью избавиться
от гетерогенности препарата антител. Антитела с одной специфичностью,
реагирующие с единственной антигенной детерминантой (моноклональные)
получают методами клеточной инженерии путем гибридизации иммунокомпетентных
B-лимфоцитов и клеток миеломных опухолей, способных к быстрому
размножению, неограниченному числу делений (в отличие от большинства
неопухолевых клеток, у которых число делений ограничено). Препараты
моноклональных антител характеризуются постоянством состава и физикохимических
свойств, низкой вероятностью перекрестной реакции с «чужими»
антигенами. Это высокотехнологичный продукт. Его недостаток – сравнительно
низкое сродство к субстрату, низкая аффинность.
Все иммуномикробиологические методы (ИМ) можно разделить на
3 группы:
– основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены
агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);
– основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом
(реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латексагглютинации,
угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания
комплемента и др.);
– с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих
антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы,
спиниммунологический и другие методы).
1.1. Реакция агглютинации (РА)
Реакция основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий
и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:
специфическая фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа)
антигена с паратопом – активным центром иммуноглобулина (невидимая
фаза);
7
Стр.7
неспецифическая (видимая) фаза – образующийся комплекс
(АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев.
Однако это явление возможно лишь в электролитной среде, например в
0,85 % растворе натрия хлорида.
РА можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке
крови и, наоборот, при помощи стандартной агглютинирующей
сыворотки можно идентифицировать выделенные микробы.
1.1.1. Ориентировочная РА для идентификации микроба
Реакция служит для предварительного определения вида микроба.
На предметное стекло наносят каплю узкоспецифичной адсорбированной
сыворотки (т.е. сыворотку, содержащую только специфические антитела).
Сыворотку наносят в разведении 1:10 и рядом – каплю физиологического
раствора (контроль). Исследуемую культуру микроба петлей вносят в обе
капли и размешивают. Через 2–4 мин учитывают результат. При положительной
реакции (соответствие исследуемой культуры диагностической
сыворотке) наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной
жидкости. В контроле – равномерная муть.
Кроме специфической агглютинации бактерий, вызванной антителами,
возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки).
Спонтанную агглютинацию дают L-формы бактерий, не образующие
гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся
в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в результате
снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической
зоне также происходит склеивание – наступает «кислотная»
агглютинация. Чтобы исключить возможность учета ложноположительных
результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с
изотоническим раствором хлорида натрия.
1.2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
РНГА является своеобразной модификацией РА. Сущность реакции
состоит в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности
эритроцитов. Такие «нагруженные» антигенами эритроциты приобретают
способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для
данного антигена. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя
на дне пробирки гемагглютинат. В последнее время РНГА получила широкое
распространение благодаря высокой чувствительности, экспрессивности
и простоте постановки.
В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных
двукратных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят 0,5 мл
заведомо положительной сыворотки и в последнюю – 0,5 мл физиологического
раствора (контроль). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разве8
Стр.8