Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное агентство по образованию
Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова
Кафедра общей и биоорганической химии
Биохимия
и молекулярная биология
Методические указания
Рекомендовано
Научно-методическим советом университета
для студентов специальности Биология
Ярославль 2005
Стр.1
УДК 577
ББК Е 072я73
Б 63
Рекомендовано
Редакционно-издательским советом университета
в качестве учебного издания. План 2005 года
Рецензент
кафедра общей и биоорганической химии Ярославского
государственного университета им. П.Г. Демидова
Составители: Г.А. Урванцева, Е.Л. Грачева
Биохимия и молекулярная биология: Метод. указания.
Б 63
2-е изд., перераб. и доп. / Сост. Г.А. Урванцева,
Е.Л. Грачева; Яросл. гос. ун-т. - Ярославль: ЯрГУ, 2005. –
55 с.
Приведены вопросы к контрольным работам и коллоквиумам,
описание лабораторных работ, выполняемых студентами
при изучении курса биохимии.
Предназначены для студентов, обучающихся по специальности
011600 Биология (дисциплина «Биохимия и молекулярная
биология», блок ОПД), очной и заочной форм
обучения.
УДК 577
ББК Е 072я73
© Ярославский государственный университет, 2005
© Г.А. Урванцева, Е.Л. Грачева, 2005
2
Стр.2
Раздел I. Белки
Работа 1. Распределительная хроматография
аминокислот на бумаге
В настоящее время метод хроматографии является одним из наиболее
простых, быстрых и точных методов анализа сложных смесей
веществ. Он основан на различиях в скорости переноса растворенных
веществ в системе двух фаз, одна из которых подвижна.
При хроматографии на бумаге неподвижной жидкой фазой является
сорбированная на поверхности бумаги вода, а подвижной -
смесь различных органических растворителей, насыщенных водой.
Разделение веществ методом хроматографии на бумаге происходит
в том случае, если эти вещества существенно различаются по своей
растворимости в обеих жидких фазах. Метод распределительной
хроматографии аминокислот на бумаге заключается в том, что каплю
смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на стартовую
линию хроматографической бумаги, конец которой опускают в
смесь органических растворителей. Чем меньше растворимость
аминокислот в воде и чем больше их растворимость в органическом
растворителе, тем быстрее они движутся за фронтом органического
растворителя. Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить
при помощи цветной реакции с нингидрином.
Подвижность веществ при хроматографии на бумаге характеризуют
с помощью коэффициента скорости движения (Rf), представляющего
собой отношение расстояния (мм), пройденного
веществом от линии старта, к расстоянию, пройденному фронтом
растворителя.
Rf =
расстояние, пройденное веществом
расстояние, пройденное растворителем
Расстояние, пройденное аминокислотой, измеряют от места ее
нанесения до середины пятна. Rf является характерной величиной
для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях.
3
Стр.3
Оборудование, реактивы: сушильный шкаф; электрическая плитка;
капиллярные пипетки; кювета эмалированная; бутанол, уксусная
кислота, вода в соотношении 40:10:50; 0,5%-ный раствор нингидрина
в ацетоне; 1%-ный раствор меди азотнокислой в ацетоне; смесь
аминокислот.
Ход работы
Для проведения анализа берут полоску хроматографической бумаги
шириной 1,5 и длиной 12 - 14 см. Смесь аминокислот (фенилаланина
и глицина) наносят в виде точки на стартовую линию,
проведенную простым карандашом на расстоянии 1 см от короткого
края бумаги. Растворы аминокислот наносят специальными капиллярными
пипетками, не допуская расплывания нанесенного раствора
до пятна диаметром более 0,2 см.
В пробирку, служащую хроматографической камерой, наливают
1 мл верхнего слоя растворителя и закрывают пробирку пробкой.
Полоску хроматографической бумаги с нанесенными аминокислотами
осторожно помещают в пробирку с растворителем, следя за
тем, чтобы растворитель был ниже линии старта. Укрепляют хроматограмму
в пробирке, которую ставят в штатив под тягой. Процесс
хроматографироавания длится 1 - 1,2 часа. По окончании указанного
срока отмечают на хроматограмме фронт растворителя и высушивают
хроматограмму над плиткой. Затем хроматограмму
проявляют 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. После испарения
ацетона при комнатной температуре хроматограммы прогревают
в термостате при 600С до появления пятен аминокислот. Для
увеличения устойчивости окраски хроматограммы обрабатывают
1%-ным раствором азотнокислой меди в ацетоне. При этом лиловая
окраска производных аминокислот переходит в оранжево-красную.
Хроматограмму высушивают на воздухе при комнатной температуре,
отмечают расположение аминокислот, вывчисляют их
Rf-индексы.
Сделайте рисунок хроматограммы и выводы по результатам опыта.
4
Стр.4
Работа 2. Определение
изоэлектрической точки белков
Вследствие наличия способных к ионизации групп (концевых
групп СООН и NH2, а также боковых групп дикарбоновых и диаминокислот)
молекулы белков обладают электрическим зарядом: положительным
и отрицательным. В кислой среде белки имеют
суммарный положительный заряд:
R-NH2 + H+ ⇔ R-NH3
+ ,
в щелочной среде - отрицательный:
R-COOH + OH- ⇔ R-COO- + H2O .
При определенном значении pH среды величина положительных
и отрицательных зарядов становится одинаковой и суммарный заряд
белка оказывается равным нулю. Значение рН, при котором белок
не имеет суммарного электрического заряда, называют
изоэлектрической точкой (ИЭТ). В этом состоянии белки наименее
устойчивы и легко выпадают в осадок, имеют наименьшее значение
вязкости, растворимости, степени гидратации и электропроводности,
не способны передвигаться к электрическим полюсам. Каждый
белок имеет свое значение ИЭТ: казеин - 4,6 - 4,7; сывороточный
глобулин - 5,4; протамины – 10 – 12; и т.д. Существует целый ряд
способов определения ИЭТ белков.
Оборудование, реактивы: пробирки, пипетки на 1, 5 и 10 мл, карандаш
по стеклу; 0,1 и 0,01 н. растворы уксусной кислоты.
Материалы: 0,5%-ный раствор желатина (растворяют 0,5 г желатина
при подогревании в 10 мл 1 н. раствора уксуснокислого натрия
и добавляют воды до 100 мл).
Ход работы
В каждую из 8 пронумерованных пробирок по нижеприведенной
таблице 1 вносят соответствующие растворы после перемешивания
5
Стр.5
+ 1 мл танина. В той пробирке, где обнаружится максимальное помутнение
среды (визуально или нефелометрически), рН раствора
будет соответствовать ИЭТ белка.
Прибавление, мл
1
Вода
0,01 н. р-р СН3СООН
0,1 н. р-р СН3СООН
Раствор белка (0,5%-ный
р-р желатина)
Танин
PH
белка.
Работа 3. Качественные реакции на белки
Методы качественного обнаружения белков основаны на трех
типах реакций: а) по пептидным связям белковой молекулы; б) по
α-аминогруппе; в) по аминокислотным радикалам.
Примером реакции первого типа служит биуретовая реакция,
второго типа - нингидриновая реакция, а к третьему типу относятся
многочисленные цветные реакции на радикалы аминокислот. По характеру
цветных реакций третьего типа можно судить до некоторой
степени о составе белков.
Оборудование, реактивы: баня водяная, пробирки химические,
стаканы химические на 100 мл; пипетки, градуированные на 1, 2, 5 и
10 мл; лакмусовая бумага, хлорид натрия (10%-ный), сульфат
аммония (насыщенный), гидроксид натрия (10 и 30%-ном), сульфат
меди (1%-ный), нингидрин (1%-ный в ацетоне 95%-ном), α-нафтол
(0,2%-ный спиртовой раствор), гипобромид натрия, ледяная уксусная
кислота, серная, соляная и азотная кислоты (конц.), нитрит натрия
(0,5%-ный), сульфаниловая кислота (5%-ная), карбонат натрия
(10%-ный), раствор плюмбита натрия.
6
2
-
8,4 7,75 8,75 8,5 8,0 7,0 5,0 1,0
0,6 1,25
-
3
-
-
5
-
6
-
8
-
0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8
По результатам опыта сделайте вывод об изоэлектрической точке
Номера пробирок
4
Таблица 1
7
-
Стр.6