Ф Е Д Е РАЛ Ь Н ОЕ АГ Е Н Т С Т ВО ПО О БРАЗО ВАНИЮ
М ИНИ С Т Е РС Т ВО О БРАЗО ВАН ИЯ И НАУ КИ РО С С И ЙСКОЙ
Ф Е Д Е РАЦИИ
Воронеж ск
ий государств
енный унив
ерситет
О С Н О ВЫ С О В РЕ М Е Н Н ЫХ М Е Т О ДОВ И ЗУ Ч Е НИЯ
Н УКЛ Е ИН О ВЫХ КИ С Л ОТ
У ч ебн
по сп еци а льн
и на п ра влен
для ст уден
и 1 к
ое пособие
ости 020201 (011600) –Би ология
ию 020200 (510600) – Би ология
т ов 3,4 к
урсов д/о
урса ма ги ст ра т уры
В О РО Н ЕЖ 2006
Стр.1
3
О глав
П о лимр аз н ая ц е
е
пн ая ре
акц ия
1.1 М еханизм полимеразной ц епной реакц ии
1.2 Детекц ия продук
1.3 П одготов
тов П ЦР
ка проб биологическ
1.4 О птимизац ия П ЦР-реакц ии
1.5 П роб лемы к
1.6 П ЦР в реальном в
1.7 Амплифик
1.8 П рименение П ЦР
К ло н ир о ван ие Д НК
2.1 П лазмидные в торы
Се н ир о ван ие ДНК
ек
кве
3.1 М етод полимеразного к
3.2 Химическ
3.3 Ав
в
томатическ
Б ло т инг н укле
4.1 Виды молек
4.2 М етоды пров
опиров
ое секениров
в
ин о вых кислот
улярной гибридизац ии
едения гибридизац ии
4.3 Зонды, используемые при гибридизац ии
ое секениров
ания (метод Сэ
ание (по М ак
ание
нгера)
саму-Г илберту)
ац ия РНК
ого материала
онтаминац ии при использов
ремени (Real Time PCR
ании П ЦР
ление
4
4
10
12
14
16
17
20
20
22
22
29
29
31
34
36
36
41
42
Стр.3
6
секениров
к
в
онц ов.
О снов
олигонук
соотв
ания; получения одноц епочечной к
ц иируется спец ифическ
пов
торяю щ ихся ц ик
етств
улярной к
ДНК; получения "тупых" 3'(синтеза
полимерной ц епи ДНК из мономерных нук
ими п ра ймера ми в к
лов. П раймеры - иск
ак прав
усств
леотиды, имею щ ие, к
ую щ им участк
праймеров, к
св
языв
прав
мож ет прив
озрастает в
к
к
в
ам ДНК-матрицы.
оторые ограничив
аясь с против
языв
ной принц ип П ЦР состоит в том, что реакц ия полимеризац ии
леотидных зв
еньев
аж дом из множ ества
енно синтезиров
С пец ифичность П ЦР определяется способностью праймеров "узнав
строго определенный участок ДНК и св
молек
П ри создании П ЦР-тест-системы одной из основ
ильный подб ор праймеров, к
ополож ными ц епями ДНК-матрицы.
оторые долж ны отв
Д линные праймеры ув
в
1. Д лина праймера долж на быть 15 - 30 нук
ести к сниж ению спец ифичности св
еличив
ероятность образов
торичных струк
ных задач яв
ечать ряду к
ритериев:
леотидов. У меньш ение длины
языв
ают спец ифичность системы, но в них сильно
ания в
ания праймера и матрицы.
тур.
2. П раймеры долж ны быть спец ифичны. О собое в
ой ДНК (к
онц ам праймеров, т.к. именно с них Taq-полимераза начинает достраив
омплементарную
их или длинных ф рагментов
праймеров и дН ТФ расходуется на синтез неспец ифическ
прив
образов аться устойчив
ритерия при в
3. П раймеры не долж ны образов ать димеры и петли, т.е. не долж но
ыв
одит к значительной потере чув ительности;
ыв
ац ии с синтезиров
ств
ых дв
самих на себя или друг с другом;
4. О б ласть отж ига праймеров долж на находиться в
делец ий или инсерц ий в пределах в
к
идов
ой или иной, в
лож ноотриц ательный результат.
5. Содерж ании ГЦ-пар в праймере долж но быть ок
ратного ув
еличения к
ц ик
пов
личность реакц ии. Как прав
торяю щ ихся ц ик
оличества к
ило, к
держ ание ГЦ-пар в праймере, тем длиннее он долж ен быть.
Эт апы ПЦР
Д ля многок
лов П ЦР состоит из трех э
ойных ц епей в результате отж ига праймеров
не зон мутац ий,
зятой в к
зону, отж ига праймеров происходить не будет, и к
ыборе праймеров, спец ифичности. П ри попадании на так
ак следств
ачестве
ую
ие -
оло 50 %. Ч ем ниже соопий
исходной ДНК нуж на
аж дый из последов
тапов:
ательно
анной посторонней ДНК.
нимание уделяют 3'ать
ероятно,
что в пробирке с реакц ионной смесью будут происходить синтез
неспец ифическ
ц епь ДНК. Е сли их спец ифичность недостаточна, то,
оротк
услож няет оц енку результатов реакц ии, т.к. легко перепутать спец ифическ
продукт амплифик
Ч асть
ой ДНК, что
). Э то значительно
ий
) инианные
ило,
размер от 15 до 30 п.н., идентичные
ать"
омплементарности. В реакц ии П ЦР используется пара
ают амплифиц ируемый участок с дв
аться с ним согласно принц ипу
ух сторон,
ляется
Стр.6
7
действ
молек
1) дена т ура ции , или "плав
ием в
2) св
языв
3) элон
ой температуры переходит в одноц епочечное состояние;
ания (от ж и га ) праймеров с матричной ДНК;
га ции , или удлинения ц епи.
ысок
На стадии термическ
ой денатурац ии (расщ епления) дв
улы ДНК при 93 – 95оС , происходит разделение к
ц епей. Затем пробы охлаж дают до 45 - 60оС , что дает в
праймерам и одноц епочечным дезок
сиолигонук
праймеров Taq-полимераза начинает достраив
к
до 70 - 72оС , что необ ходимо для работы Taq-полимеразы. С мена э
к
онца праймера, при э
аж дого ц ик
последов
св
языв
к
аю тся с к
предыдущ их ц ик
последов
аив
амплифик
ф фек
огда к
а затем его э
«э
В зав
ла осущ еств
смеси.
Сначала праймеры могут св
ательностью исходной ДНК, но в последую щ их ц ик
опиями э
лах. П ри э
той последов
том к
оличество основ
удв ается в к
э
споненц иально.
С ледует заметить, что проц есс нак
ац ии по геометрическ
ф фек ность к
тив
проц есса нак
к
оличество амплик
том плато» . Т ермин «э
опления продук
исимости от услов
на момент достиж ения «э
(дН ТФ и праймеров
к
онц ентрац ия ДНК-миш ени, тем в
момент мож ет наступить до того, к
амплифик
И збеж ать э
полимеразу; к
при в
к
ысок
реакц ии амплифик
ой к
ффек
ного продук
ание в
том температура реакц ионной смеси в
уц епочечной
озмож ность св
омплементарных
язаться
леотидам. П осле отж ига
торой ц епи ДНК с 3'новь
пов
ыш ается
тапов
ляется путем изменения температуры реакц ионной
язаться только с определенной
ательности, синтезиров
лах они
та П ЦР (к
анными в
опии
ательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически
аж дом ц ик
ле, то есть растет с числом ц ик
опления спец ифическ
ой прогрессии идет лишь ограниченное в
ритически падает. Э то св
ф фект плато» используют для описания
тов П ЦР на последних ц ик
язано с так назыв
лах амплифик
онов достигает 0.3 - 1 пмолей.
ий и к
оличества ц ик
та плато» в
лов реакц ии амплифик
ингибиторов, влю чая пироф осф аты и ДНК-дуплек
продук
ого продук
тов амплифик
ыше риск в
ак к
ты или праймер-димеры, к урирую щ ие за праймеры, дН ТФ и
онц ентрац ия спец ифическ
онц ентрац ии продук
); стабильность реагентов (дН ТФ и фермента); к
онк
оличество спец ифическ
Ч тобы уменьш ить риск образов
ий отж иг праймеров.
оляют лишь хорошо оптимизиров
ац ии, используют подход, получив
ания неспец ифическ
ш ий назв
старт» (от англ. «hotstart » ). Суть его состоит в предотв
начала реакц ии до момента достиж ения в пробирке услов
спец ифическ
ац ии будет достаточно, чтобы их мож но было проанализиров
того позв
ращ ении в
ий, обеспечив
анные тест-системы.
их продук
их продук
ремя,
аемым
ац ии,
ац ии,
лияют: утилизац ия субстратов
оличество
ие
сы; неспец ифическ
та и неполная денатурац ия
ац ии. Ч ем меньше начальная
ыхода реакц ии на плато. Э тот
их продук
ание «горячий
озмож ности
аю щ их
лов
тов
ления" ДНК, к
огда дв
ух ц еп очечная ДНК под
тов
ать.
тов
Стр.7
8
Дело в том, что в зав
одородных св
определенную температуру плав
в
праймер не в состоянии удерж ив
соб лю дении оптимальных услов
температуре плав
при услов
ии его полной к
«горячего старта» :
1. в
ц ик
парафина или в
св
исимости от ГЦ-состава и размера праймеры имеют
ления (Tm), при к
оторой об разов
язей нестабильно. Е сли температура системы прев
ления, праймер образует дв
спец ифичность реакц ии. Сущ еств
омплементарности и, так
ание
ыш ает Т m,
аться на ц епи ДНК и денатурирует. П ри
ий, т.е. температуры отж ига, б лизк
ухц епочечную молек
уют различные в
несение в реакц ионную смесь Taq-полимеразы во в
полимераза и ДНК-миш ени), к
температуры плав
3. использов
язанный монок
стадии перв
ой денатурац ии, к
денатурируют и осв
Во в
ла после прогрева пробирки до температуры денатурац ии;
2. разделение ингредиентов реакц ионной смеси прослойк
оска на части (в ниж ней - праймеры, в в
оторые смеш ив
ления материала прослойки (~45 - 85ºС );
ание монок
лональными антителами, станов
огда монок
тив
произош ел до начала температурного ц ик
происходит, а при нагрев
поэ
ании к
температура в пробирке не опуск
обеспечив
тому неспец ифическ
ает образов
Амп лификация
Стандартная П ЦР осущ еств
одной пробирке, содерж ащ ей ок
праймера, по 50 мк
молей к
к
позв
ие продук
ание спец ифическ
сы праймер-ДНК денатурируют,
ты не образую тся. В дальнейш ем
ается ниже температуры плав
ого продук
омплек
ления, что
та амплифик
ляется ав
аж дого дезок
оло 1 мкг ДНК, 20 пик
синук
единицы термостабильной Taq ДНК-полимеразы.
П роба со месью помещ аю тся в металлическ
оторого изменяется с помощ ью э
продолж ительность к
оляет изменять температуру б лока с больш ой ск
аж дого ц ик
ла П ЦР.
ац ии.
томатически в термоц ик
омолей к
лере в
аж дого
лемента П ельтье. Э лемент П ельтье
оростью , что сок
леозидтриф осф ата и две
ий б лок, температура
ращ ает
тив
ремя перв
ого
ой, например,
ерхней - Taqаю
тся при достиж ении
лональных антител к Taq-полимеразе. Ф ермент,
ится ак ным лишь после
сех перечисленных случаях, даже если неспец ифическ
лиров
обож дают ак ные ц ентры Taq-полимеразы.
ания, э
лональные антитела необратимо
ий отж иг
лонгац ии не
ой к
им образом, обеспечив
арианты реализац ии
улу только
ает
Стр.8