Методы молекулярно-биологических и генно-инженерных исследований. (110,00 руб.)

Стр.1

Стр.3

Стр.6

Стр.7

Стр.8

Ф Е Д Е РАЛ Ь Н ОЕ АГ Е Н С ТВО ПО О Б РАЗО ВАНИЮ М ИНИ С Т Е РС Т ВО О Б РАЗО ВАН ИЯ И Н АУ КИ РО СС И ЙСКОЙ Ф Е Д Е РАЦИИ Вороне кжс ий гос ударс етвнный униврсе итет М Е Т О ДЫ М О Л Е КУ Л ЯРНО -Б И О Л О Г И ЧЕ СКИХ И Г Е ННО -И Н Ж Е Н Е РН ЫХ И СС Л Е Д О ВАНИЙ У че по сп е бно-м е тодичек сое пос обие ц и ал ь н ости 020201(011600) – Би ол огия В оронеж 2005

Стр.1

Г Л АВА I. М Е Т О ДЫ ВЫ Д Е Л Е Н ИЯ И КО Л И ЧЕ С ТВЕ Н Н О ГО АН АЛ И ЗА Н УКЛ Е ИН О ВЫХ КИ С Л ОТ Те тичес ие ос оре к пре ж де вс е го получ новы м е тодов Чт обы проводить моле кулярный ана лиз нукле иновых кис лот , нуж но ить их в ч ис т ом виде . Типич ная кле т ка че лове ка в норме с оде рж ит приме рно 7 пг ге номной ДНК и около 15 пг РНК. Из них 80-85% приходит ся на долю рибос омной (28S, 18S и 5S) РНК, а ос т а льная ча с ть пре дс т а вле на в основном низкомоле кулярными РНК. Лишь 1-5% сумма рной РНК с ос т а вля ет ма т рич poly(A)-«хвос т». Б ла года ря эт ому возмож но оч ме мбраны (а т акже кле т оч кле т оч аффинной хрома т ографии на олиго-(dT)-це ллюлозе , а т акже получ ная РНК (мРНК). мРНК эука риот име ет на 3’-конце ис т ить мРНК с помощ ью ить копию мРНК (копийную ДНК, или кДНК), ис пользуя олиго-(dT) праймер. Для выде ле ния ге номной ДНК разруша ют плазма т иче скую и яде рную ную с т е нку ра с т е ний и грибов) и ос вобож дают ся от ных бе лков. Из водных ра с т воров ге номную ДНК мож но ос адить доба вле нием эт анола или изопропанола . О быч ДНК разме ром 100-200 тысяч пар нукле от идов (п.н.), пригодные для большинс т ва пос ле дующ их ана лизов. О дной из прич ДНК. Сущ е с т вуют лишь не кот орые ме т одологиче ские различ выде ле ния РНК проводят лизис кле т ок, де прот е иниза ц ию кле т оч проводить в одноразовых ре зиновых пе рча тках. О бщ ие принципы м е тодов эктрак с ции РНК П ре па рат РНК мож ет быть получ ен как из с ве ж ей, т ак и заморож е нной в ж идком азоте или на -70°C тка ни. Б ольшинс т во ме т одов экс т ракц ии нукле иновых кис лот , кот орые мы будем ис пользовать в данном ц икле работ , основаны на обработ ке гомоге на т ов тканей с м ес ью ф ен ола с хлороформ ом . П ринц ипиа льную с хе му ме т одов фе нол-хлороформной экс т ракц ии нукле иновых кис лот мож но пре дс т а вить с ле дующ им образом. Ткань, из кот орой выде ляют ДНК или РНК, гомоге низируют в присут с т вии ве щ е с тв, 3 но получают ся фра гме нты ин фра гме нт а ц ии ге номной ДНК явля е т ся ме ханиче ское возде йс т вие в проце ссе выде ле ния. П оэт ому образцы с ле дует пе ре ме шивать оче нь ос т орож но. Ме т оды выде ле ния сумма рной РНК из тканей ана логич ны экс т ракц ии ия. Для ного лиза та и от де ле ние РНК от ДНК. О дна ко РНК по с ра вне нию с ДНК гораздо более лабильна и ус т ойч ива к де йс т вию нукле аз. П оэт ому все работы с РНК с ле дует

Стр.3

3) Серебрян 0,5 мл ра с т вора дифе ниламина и с т а вят пробирку на кипящ ую водяную баню на 15 мин. Развива е тся зе лёная окра с ка ж идкос ти вс ле дс т вие вза имоде йс т вия рибозы с дифе ниламином. ая проба на пури н овые осн 4) Моли бден ован ия. К 1 мл гидролиза та дрож ж ей прилива ют 2 ка пли конце нт рированного ра с т вора аммиа ка и 5 ка пе ль 1% ра с т вора нит ра та аммония. Че рез 3-5 мин выпада ет бурый ос адок с е ре бряных с ое дине ний пуриновых оснований. овая проба на фосфорн ую ки с лоту. К 1 мл гидролиза та дрожж ей приба вить 5 ка пе ль молибде нового ре акт ива и ос т орож но кмпя т ить не сколько минут . Развива е т ся лимонно-ж ёлт ая окра с ка ж идкос ти вс ле дс т вие образования фосфорномолибде нового аммония по ре акц ии H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3 -> (NH4)3PO4x12MoO3+21NH4NO3+12H2O. РАБ О ТА № 2 КО Л И ЧЕ С Т В Е Н Н ЫЙ АН АЛ ИЗ Н УКЛ Е ИН О ВЫХ КИ С Л ОТ Для опре де ле ния конце нт ра ц ии ДНК и РНК в ра с т воре широко ис пользуют ся два ме т ода . сп ет рофот оме ч к т ри че ий ме Н а иболее ск прос тым и т оч ным т и д и ем . явля е тся т од , одна ко он облада ет с ра внит е льно ма лой то конце нт ра ц ию ДНК и РНК мож но опре де лить по инт е нс ивнос ти их флюоре с ц е нц ии в УФ -с ве те пос ле ок увс т вит е льнос т ью. Ес ли общ ее с оде рж ание нукле иновых кис лот не ве лико, раши ван ия бром и ст ым э Спект рофот ом ет ри ч ес кий м ет од Конце нт ра ц ию нукле иновых кис лот в ра с т воре мож но ра ссч двухце почеч ной ДНК 33 мкг/мл, одноце почеч ит ать, изме рив е го опт иче скую плотнос ть (A) при 260 нм (A260). Данная длина волны явля е т ся макс имумом поглощ е ния аде нина . О дна е диница A260 приме рно с оот ве т с т вует конце нт ра ц ии одноце почеч ной ДНК 50 мкг/мл, ной РНК 40 мкг/мл. С пе кт рофот оме т риче ский ме т од т акже позволя ет оце нить ч Крит е рием ч ис т оту образц ов. ис т оты пре па ра т ов ДНК и РНК явля е тся отноше ние A260/A280 1,8 и 2, с оот ве т с т ве нно (A280 – макс имум поглощ е ния а рома т иче ских аминокис лот ). Ес ли это отноше ние ме ньше , пре па раты за грязне ны бе лками или фе нолом, и оце нка конце нт ра ц ии будет не ве рна . Окраш и ван ие бром и с т ым эт и ди ем Э ле кт рофоре т иче ский ме т од Для приме рной оц е нки конце нт ра ц ии пре па ра т ов ДНК или РНК на ге ль нанос ят разные количе с т ва ма рке рных нукле иновых кис лот (с изве с тной 6

Стр.6

конце нт ра ц ией). Конце нт ра ц ию исс ле дуе мых пре па ра т ов нукле иновых кис лот оце нива ют , с ра внивая инт е нс ивнос ть флюоре с ц е нц ии образца и с т анда ртных ма рке ров. В а ж но, чт обы образцы ДНК и РНК с ра внива лись с с оот ве т с т вующ ими ма рке рами, поскольку при одинаковом количе с т ве ДНК и РНК инт е нс ивнос ть их флюоре с ц е нц ии в УФ -с ве те различа е т ся . Ме т од пя т ен Конце нт ра ц ию нукле иновых кис лот мож но опре де лить, окра с ив ра с т вор бромис тым эт идием, изме рив инт е нс ивнос ть флюоре с це нц ии в УФ -с ве те и с ра внив её с флюоре с це нц ией ма рке ров изве с тной конц е нт ра ц ии. Це ль работы: опре де лить конце нт ра ц ию и ч ге номной ДНК и сумма рной РНК. М ате О борудов риалы ь Б уфер Трис -HCl ь Ра с т вор бромис т ого эт идия: 1 мкг/мл в воде ание. С пе кт рофот оме тр, УФ -т ранс иллюмина т ор, микропипе т ки. Х од работы Спект рофот ом ет ри ч ес кий м ет од 1. Ра с т ворить не сколько мкл пре па ра та нукле иновой кис лоты в минима льном объёме Трис -HCl буфе ра , дос т а т оч с пе кт рофот оме т рирования. В ыч (Kр=Vобщ ий/Vпре па ра та ). ном для ис лить коэффиц ие нт разба вле ния 2. Изме рить A260 разба вле нного ра с т вора нукле иновой кис лоты. 3. В ыч Коненц т рац Коненц т рац ДНК = A260 x 50 x Kр (мкг/мкл) 1000 ия с умм арн ой РНК = A260 x 40 x Kр (мкг/мкл) 1000 4. Изме рить A280 и выч ис лить отноше ние A260/A280. Сде лать вывод о ч пре па ра т ов. Э лект рофорет и ч ес кий м ет од 1. Гот овят с е рию разве де ний образца ДНК или РНК и с оот ве т с т вующ их с т анда ртных ра с т воров в буфе ре Трис -HCl и доба вляют ко вс ем разве де ниям ра вный объём бромис т ого эт идия. 7 ис т оте ис лить конце нт ра ц ию образц ов ДНК и РНК по формулам ия дц ис т оту пре па ра т ов

Стр.7

2. На т ранс иллюмина т ор кладут кус оч SaranWrap). ек пла с т иковой плёнки (т ипа 3. На плёнку нанос ят по 5 мкл ка ж дого разве де ния и с т анда ртного ра с т вора . 4. О пре де ляют конце нт ра ц ию образца , с ра внивая А льт ерн в агарозн н уклеи н ым подходом являет ся элект рофорез разведен ом геле с пос ледующ ей оц кой и н овых ки с лот в УФ -с вете. ен т енс и вн ос ти с веч ен инт е нс ивнос ти флюоре с ц е нц ии с т анда ртного ра с т вора и разве де ний. Для обле гче ния оце нки мож но сфот ографировать плёнку. ат и вн ий ДНК и ли РНК ия полос РАБ О ТА № 3 ВЫ Д Е Л Е НИЕ Г Е Н О М Н ОЙ ДНК ИЗ ТКАН ЕЙ И КУ Л Ь Т У РЫ КЛ Е ТОК М Л Е КО ПИ ТАЮ Щ ИХ Це ль работы: подгот овить пре па рат ге номной ДНК из тканей и культуры кле т ок мле копит ающ их М ате риалы • Ж идкий азот ь Ра с щ е пляющ ий буфер ь Б уфер PBS, охла ж дённый на льду ь Сме сь фе нол/хлороформ/изоамиловый с пирт (25:24:1) ь 7,5 М ра с т вор а це т а та аммония • 96-100% эт анол ь 70% эт анол ь Б уфер TE, pH 8,0 О борудов Х од работы Выделен ие ДНК из т кани 1. О рган (или е го часть), из кот орого выде ляют ДНК, изме льч ёта 1,2 мл на 100 мг тка ни. ить и быс т ро заморозить в ж идком азоте . Ра с т е ре ть заморож е нную ткань в охла ж дённой с тупке до с ос т ояния порошка . Сус пе ндировать в лизирующ ем буфе ре из ра сч Выделен ие ДНК из культ уры клет ок 1. а ) Ц е нт рифугировать культуру кле т ок при 500 g и уда лить супе рна т а нт . б) Ре сус пе ндировать кле т ки в 1-10 мл охла ж дённого на льду буфе ра PBS. Ц е нт рифугировать 5 мин при 500 g, уда лить супе рна т а нт и повт орить. Ре сус пе ндировать кле т ки в 1 мл лизирующ е го буфе ра . Е с ли коли ч ес т во 8 ание. С тупка и пе с тик, це нт рифуга , на с т ольная микроце нт рифуга , микропробирки, це нт рифуж ные пробирки на 50 мл, ле дяная ба ня.

Стр.8