На правах рукописи Хабибуллина Ирина Ифировна РАЗРАБОТКА ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ КИНЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ РАЦЕМИЧЕСКИХ СПИРТОВ, КИСЛОТ И ЭФИРОВ Специальность 03.00.23 – «Биотехнология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Казань – 2007 Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета Научный руководитель доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович. <...> Важнейшими синтонами при производстве лекарственных препаратов и биологических средств защиты растений являются оптически чистые энантиомеры спиртов, кислот и сложных эфиров. <...> Наиболее эффективными способами получения таких соединений является кинетическое разделение их рацемических смесей парциальным ацилированием или энантиоселективным гидролизом с помощью гидролаз микроорганизмов (эстераз и липаз), отличающихся высокой селективностью, широкой субстратной специфичностью, активностью, стабильностью, способностью работать как в воде, так и в органических растворителях. <...> Клетки микроорганизмов с успехом применяются в качестве катализаторов во многих процессах регио- и энантиоселективной трансформации органических соединений. <...> Принимая во внимание успехи, достигнутые в создании ω-функциональной боковой изопреноидной цепи α-токоферола с 2-мя хиральными центрами Rконфигурации на основе хлорофилла, разработка биокаталитического метода получения S-хроманилэтанола - ключевого синтона полного аналога природного αтокоферола - является важной задачей на пути создания альтернативной технологии получения витамина Е на основе доступного растительного и нефтехимического сырья. <...> В связи с этим создание доступных, технологичных и энантиоселективных катализаторов для синтеза оптически активных S-хроманилэтанола (ключевого синтона в синтезе витамина Е) и S-кетопрофена <...>
Разработка_энантиоселективных_биокатализаторов_кинетического_разделения_рацемических_спиртов,_кислот_и_эфиров.pdf
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Важнейшими синтонами при производстве
лекарственных препаратов и биологических средств защиты растений являются
оптически чистые энантиомеры спиртов, кислот и сложных эфиров. Наиболее
эффективными способами получения таких соединений является кинетическое
разделение их рацемических смесей парциальным ацилированием или
энантиоселективным гидролизом с помощью гидролаз микроорганизмов (эстераз и
липаз), отличающихся
высокой селективностью, широкой субстратной
специфичностью, активностью, стабильностью, способностью работать как в воде,
так и в органических растворителях.
Клетки микроорганизмов с успехом применяются в качестве катализаторов во
многих процессах регио- и энантиоселективной трансформации органических
соединений. Использование их в качестве биокатализаторов кинетического
разделения более перспективно по сравнению с ферментными препаратами,
учитывая, с одной стороны, высокие затраты материалов и энергии на
концентрирование и выделение внеклеточных и внутриклеточных ферментов, а с
другой - значительный расход ферментов во время трансформации. Кроме того,
важнейшим преимуществом интактных клеток перед ферментными препаратами
явлется возможность их регенерации и многократного использования.
Принимая во внимание успехи, достигнутые в создании ω-функциональной
боковой изопреноидной цепи α-токоферола с 2-мя хиральными центрами Rконфигурации
на основе хлорофилла, разработка биокаталитического метода
получения S-хроманилэтанола - ключевого синтона полного аналога природного αтокоферола
- является важной задачей на пути создания альтернативной технологии
получения витамина Е на основе доступного растительного и нефтехимического
сырья.
Использование методов
энантиоселективной
биотрансформации
с
применением клеток микроорганизмов также является перспективным подходом к
синтезу оптически активного S-кетопрофена – ценного предшественника в синтезе
нестероидных противовоспалительных препаратов.
В связи с этим создание доступных, технологичных и энантиоселективных
катализаторов для синтеза оптически активных S-хроманилэтанола (ключевого
синтона в синтезе витамина Е) и S-кетопрофена (синтона нестероидных
противовоспалительных препаратов) является актуальной задачей.
Цель работы. Разработка энантиоселективных биокатализаторов для
получения оптически активных S-(-)-6-бензилокси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8тетраметилхромана
и S-(+)-2(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты на основе
микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью. Поиск методов
интенсификации процессов кинетического разделения оптически активных спиртов,
кислот и эфиров.
В связи с этим задачами работы являлись:
• осуществление скрининга микроорганизмов, обладающих липолитической и
эстеразной активностью;
• исследование свойств перспективных штаммов с целью их идентификации;
• разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального разделения
спиртов, кислот и эфиров в процессах этерификации и гидролиза на основе клеток
микроорганизмов
с
целью
получения
оптически
S-хроманилэтанола, энантиомеров других спиртов и S-кетопрофена;
• исследование условий эффективной работы и стабильности биокатализаторов;
3
активных
Стр.3
• разработка методов получения оптически активных S-хроманилэтанола и
S-кетопрофена с использованием созданных биокатализаторов;
• исследование подходов к интенсификации процессов кинетического
разделения спиртов и эфиров.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой
программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и
фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт №
02.438.11.7003), региональной программой РФФИ "Агидель" (2005г.), планами
научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного
технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой
“Развитие научного потенциала высшей школы” (проект «Научно-образовательная
деятельность музея, созданного на базе кафедры биохимии и технологии
микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного
технического университета» 2005-2006 гг.).
Научная новизна. Выделены и идентифицированы новые микроорганизмы
родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (K3-2), на основе
которых
созданы энантиоселективные
биокатализаторы,
проявляющие
каталитическую активность при парциальном ацилировании R,S-хроманилэтанола,
переэтерификации R,S-кетопрофена и энантиоселективном гидролизе их
рацемических эфиров.
Научно обоснованы методы синтеза оптически активных S-(−)-6-бензилокси2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана
и
S-(+)-2-(3-бензоил-фенил)
пропионовой кислоты с использованием биокатализаторов на основе
микроорганизмов родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (K3-2).
Обнаружена инверсия R-(+)-хроманилэтанола в S-(−)-хроманилэтанол в присутствии
биокатализатора на основе культуры микроорганизма, относящегося к роду
Rhodococcus (77-32). Найдены условия (температура, рН, растворитель), в которых
биокатализаторы проявляют наивысшую активность. Разработаны методы
увеличения активности биокатализаторов путем их обработки органическими
растворителями. Показано, что в условиях кинетического разделения
биокатализаторы проявляют высокую стабильность. Доказана возможность
многократного использования разработанных биокатализаторов.
Практическая значимость. На основе найденных культур микроорганизмов
родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (K3-2) созданы
энантиоселективные биокатализаторы и эффективные методы получения S-(−)хроманилэтанола
– ключевого синтона витамина Е и S-(+)-кетопрофена –
предшественника нестероидных противовоспалительных препаратов высокой
оптической чистоты.
Разработаны методы увеличения активности ранее описанных катализаторов
энантиоселективного гидролиза рацемических эфиров вторичных спиртов не
снижающие энантиоселективность.
Результаты научных исследований легли в основу создания новых
лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров
по специальности 240901 - «Биотехнология».
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены
на 55,56 и 57-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых
ученых УГНТУ (Уфа, 2004-2006), V Всероссийском научном семинаре и
Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), IV Всероссийской
научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в
4
Стр.4