МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 616.98:579.835.12
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ПРОГНОЗА
ИНФИЦИРОВАНИЯ HELICOBACTER PYLORI
Елизавета Сергеевна АГЕЕВА1, Ольга Владимировна ШТЫГАШЕВА1,
Наталья Владимировна РЯЗАНЦЕВА2, Владимир Николаевич ХАРЬКОВ3,
Вадим Анатольевич СТЕПАНОВ3
1 Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова
665017, г. Абакан, пр. Ленина, 92
2 ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития РФ
634050, г. Томск, Московский тракт, 2
3 НИИ медицинской генетики СО РАМН
634050, г. Томск, Набережная реки Ушайки, 10
Изучено распределение генотипов полиморфных локусов генов С +3953Т IL-1β, IL-1Ra VNTR, –174 G>C
IL-6, –251 T>A IL-8 у коренных и пришлых жителей Республики Хакасия, больных язвенной болезнью и
хроническим гастритом, ассоциированных с Helicobacter pylori. Установлена взаимосвязь между генотипом
АА –251 IL-8 и риском развития язвенной болезни у хакасов. У европеоидов риск развития заболевания ассоциирован
с генотипом СС +3953 IL-1β и R2R3 IL-1Ra.
Ключевые слова: полиморфизм генов, иммунный ответ, Helicobacter pylori, язвенная болезнь, хакасы.
На сегодняшний день имеется достаточно
фактов, свидетельствующих о значении генетических
факторов макроорганизма в определении
особенностей иммунного ответа и, следовательно,
восприимчивости/резистентности организма
к заболеваниям. Определенный интерес
представляют данные о роли полиморфных вариантов
генов интерлейкинов в патогенезе гастродуоденальной
патологии (злокачественные
новообразования, хронические воспалительные
заболевания, в том числе инфекционной природы).
При этом особое значение придается популяционным
особенностям.
В настоящее время накоплены данные о
роли аллельных вариантов ряда генов в патогенезе
заболеваний, ассоциированных с Helicobacter
pylori (НР). Так, показано, что аллельные
варианты кластера генов IL-1 (IL-1β –511Т, IL1Ra
R2R2) связаны с высоким риском развития
рака желудка у представителей корейской
популяции, инфицированных НР. В японской
популяции не было выявлено достоверной связи
между аллельным вариантом IL-1β –511Т и
риском развития НР-ассоциированного рака желудка
[1, 2]. В то же время было установлено,
что у японцев аллель А –251 IL-8 ассоциирован
с прогрессией атрофических изменений в слизистой
оболочке желудка у пациентов с НР и
увеличивает риск развития язвенной болезни
и рака желудка [3, 4]. В китайской популяции
риск развития рака желудка связывают с наличием
генотипа ТА –251 IL-8 [5]. Z. Gyulai et al.
показали существование зависимости между
носительством генотипа ТТ –251 IL-8 и риском
развития дуоденальной язвы [6]. Возможным
объяснением этому является наличие популяционно-зависимых
ассоциаций между аллелями
генов и клиническими особенностями инфекционного
процесса [2, 7].
При проведении эпидемиологического исследования
распространенности язвенной болезни
у коренных и пришлых жителей РесАгеева
Е.С. – к.м.н., зав. кафедрой фундаментальной медицины и гигиены, е-mail: Ageevaeliz@rambler.ru
Штыгашева О.В. – д.м.н., проф., зав. кафедрой внутренних болезней, e-mail: olgashtygasheva@rambler.ru
Рязанцева Н.В. – д.м.н., проф., зав. кафедрой фундаментальных основ медицины, e-mail: nv_ryazan@mail.ru
Харьков В.Н. – к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории эволюционной генетики,
e-mail: vladimir.kharkov@medgenetics.ru
Степанов В.А. – д.б.н., проф., руководитель лаборатории эволюционной генетики,
e-mail: vadim.stepanov@medgenetics.ru
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 31, № 6, 2011
5
Стр.1
Агеева Е.С., Штыгашева О.В., Рязанцева Н.В. и др. Генетические детерминанты прогноза… /c. 5–9
публики Хакасия выявлено, что при высокой
инфицированности НР (95,4 % среди европеоидов
и 95,2 % среди хакасов) заболеваемость
язвенной болезнью в двух популяциях, проживающих
на территории Хакасии, различалась
(8,1 % у европеоидов и 4,5 % у хакасов) [8]. Установленная
взаимосвязь между распространенностью
НР и ассоциированностью бактерии
с язвенной болезнью у коренных и пришлых
индивидов свидетельствует о наличии популяционно-наследуемых
особенностей, оказывающих,
по всей видимости, влияние на характер
взаи модействия микроорганизма и организма
хозяина. В связи с этим интересным является
ис следование молекулярно-генетических механизмов,
реализация которых влияет на течение
инфекционного процесса.
Целью работы послужило выявление иммуногенетических
особенностей, детерминирующих
исход инфицирования НР у коренных и
пришлых жителей Хакасии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объект исследования – больные язвенной
болезнью двенадцатиперстной кишки (21 европеоид
и 25 хакасов), хроническим гастритом (59
европеоидов и 63 хакаса). Контрольную группу
составили здоровые доноры (60 европеоидов и
63 хакаса). Все обследованные – коренные (хакасы
или монголоиды) и пришлые жители Республики
Хакасия (русские или европеоиды). В
исследовании приняло участие сопоставимое
количество мужчин и женщин, средний возраст
европеоидов был 43,6 года, хакасов – 42,9
года.
Наличие у пациентов НР диагностировали
с использованием четырех методов: морфологического,
быстрого уреазного, серологического
(определение уровня специфических IgG к
НР в сыворотке крови методом твердофазного
иммуноферментного анализа) и полимеразной
цепной реакции (ПЦР).
Для исследования аллельных полиморфизмов
генов ДНК выделяли из венозной крови
методом
фенол-хлороформной
экстракции.
Амплификацию осуществляли методом ПЦР,
используя структуру следующих праймеров:
F: gttgtcatcagactttgacc и R: ttcagttcatatggaccaga
(С+3953Т IL-1β), F: ctcagcaacactcctat и R: tcctggtctgcaggtaa
(IL-1Ra VNTR), F:
tgacttcagctttactctttgt
и R: ctgattggaaaccttattaag (–174 G>C
IL-6), F: tgttctaacacctgccactctagta и R: ttatgcaccctcatcttttcattat
(–251 Т>А IL-8) («Сибэнзим», Новосибирск).
Наличие полиморфных вариантов
аллелей формирует сайты для распознавания
6
соответствующей рестриктазой. К амплификатам
добавляли смесь для рестрикции, содержащую
один из ферментов (при генотипировании
С+3953Т IL-1β – Taq I, –174 G>C IL-6 – SfaNI,
–251 Т>А IL-8 – Mfe I) и BSA-буфер. Температурный
режим и время соответствовали приложенной
инструкции
фирмы-производителя
(«Сибэнзим»). Продукты рестрикции анализировали
с помощью электрофореза в 4 % агарозном
геле. В качестве маркера размера ДНК
использовали плазмиду pUC19, расщепленную
рестриктазой MspI («Сибэнзим»).
В работе с пациентами опирались на этические
принципы, отраженные в Конституции
РФ и Хельсинкской декларации всемирной медицинской
ассоциации (2000). У всех пациентов
было получено информированное согласие,
под тверждающее их добровольное участие в
иссле довании.
Распределение генотипов по исследованным
полиморфным локусам проверяли на соответствие
равновесию Харди–Вайнберга с помощью
критерия χ2, расчет проводили в пакете статистических
программ GENDIST, разработанным
д.б.н. В.А. Степановым. Сравнение частот аллелей
и генотипов проводили с помощью критерия
χ2 с поправкой Йетса на непрерывность, анализ
ассоциации полиморфизмов с хроническим
гастритом и язвенной болезнью – с помощью
критерия отношения шансов (ОШ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Фактором, замыкающим на себе ключевые
звенья патогенеза НР-персистенции в слизистой
оболочке желудка (воспаление, апоптоз, гипохлоргидрия),
является IL-1β. Выраженность
эффектов интерлейкина зависит от уровня экспрессии
как самого продукта, так и антагониста
рецептора интерлейкина IL-1Ra. В результате
проведенного нами исследования установлено,
что среди хакасов наиболее распространен низкопродуцирующий
генотип СС +3953 IL-1β (см.
таблицу). У больных язвенной болезнью количество
гомозигот СС было выше, чем у пациентов
с хроническим гастритом и в группе контроля
(р < 0,05). Гетерозиготы СТ встречались
чаще у пациентов с хроническим гастритом по
сравнению с больными язвенной болезнью и
здоровыми донорами (р < 0,05). Гомозиготы ТТ
(для которых характерен низкий уровень продукции
IL-1β) в нашем исследовании являлись
редким генотипом (см. таблицу).
У европеоидов доминирующим генотипом
также являлся СС +3953 IL-1β, доля которого
была выше у больных хроническим гастритом
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 31, № 6, 2011
Стр.2
Агеева Е.С., Штыгашева О.В., Рязанцева Н.В. и др. Генетические детерминанты прогноза… /c. 5–9
Таблица
Распределение частот генотипов (%) у европеоидов и хакасов, носителей Helicobacter pylori,
больных хроническим гастритом и язвенной болезнью
Хакасы
Полиморфизм генов
С +3953Т
IL-1β
χ², р
IL-1Ra
VNTR
χ², р
–174 G>C
IL-6
χ², р
–251 Т>А
IL-8
χ², р
ТТ
ТА
АА
GG
GC
CC
R2R2
R2R3
R2R4
R3R3
R3R4
R4R4
СС
СТ
ТТ
Здоровые
доноры
25,2
1,6
2,9
0,0
0,0
6,8
Больные
ХГ
36,5
0,0
1,7
0,0
1,7
7,0
ЯБ
73,2 63,5 84,0 2
16,0 2
0,0
0,0
0,0
0,0
4,0
Здоровые
доноры
45,6 3
33,3
21,1 3
5,1
2,9
Европеоиды
Больные
ХГ
58,9 1
24,8
16,3
0,22, > 0,05 4 0,24, > 0,05 4 2,91, > 0,05 4 2,39, > 0,05 4 2,39, > 0,05 4
9,5 3
19,1
11,6
10,7
79,6
70,0
27,1
2,9
14,0
75,4
75,0
25,0
0,0
20,01
76,0
73,9
21,7
4,4
27,4 3
33,9 3
12,2 1
14,3 3
9,7
21,8
32,5 3
49,6 3
11,6 3
42,8
44,4
12,8
45,4
43,7
10,9
44,8
24,1 1,2
31,0 1,2
0,07, > 0,05 4
36,1
45,8
18,1
36,2 3
47,1 3
16,7
34,4
46,8
18,8
ЯБ
70,6 1, 3
17,6 1
11,8
7,84, < 0,05
12,4
18,1 1
21,7
17,4 3
11,5 1,2
18,9 1,2,3
37,88, > 0,05 4 0,77, > 0,05 4 34,49, < 0,05 2,81, > 0,05 4 2,70, > 0,05 4 6,26, > 0,05 4
38,8 3
28,9 3
52,7 3
18,4 3
0,05, > 0,05 4 0,25, > 0,05 4 1,12, > 0,05 4 0,29, > 0,05 4 0,002, > 0,05 4 0,02, > 0,05 4
26,1 3
56,6 3
17,3 3
9,06, < 0,05 0,00, > 0,05 4 0,02, > 0,05 4 0,89, > 0,05 4 2,84, > 0,05 4
Примечание. Достоверное (p < 0,05) отличие от величины соответствующего показателя: 1 – здоровых доноров,
2 – пациентов с хроническим гастритом, 3 − хакасов; 4 – распределение частот генотипов, соответствующее закону Харди–Вайнберга.
ХГ – хронический гастрит, ЯБ – язвенная болезнь.
и язвенной болезнью по сравнению с контролем
(см. таблицу). Анализ показал, что у европеоидов
риск развития язвенной болезни ассоциирован
с генотипом СС +3953 IL-1β (ОШ = 2,9, 95 %
доверительный интервал ДИ 1,6–5,6). В отношении
гетерозигот СТ +3953 IL-1β и гомозигот ТТ
+3953 IL-1β у европеоидов отмечалось снижение
показателей по сравнению с контролем (см.
таблицу). У пациентов с язвенной болезнью генотипы
СТ и ТТ +3953 IL-1β встречались реже,
чем у пациентов с хроническим гастритом и в
группе контроля (р < 0,05).
При межпопуляционном сравнении распространенности
генотипов у здоровых коренных
и пришлых жителей обнаружено, что гомозиготы
СС +3953 IL-1β чаще встречаются у хакасов,
чем у европеоидов, в то время как гомозиготы
ТТ +3953 IL-1β − напротив, существенно реже.
При изучении полиморфизма гена IL-1Rа
установлено, что во всех обследованных группах
доминирует генотип R4R4 IL-1Rа, при этом
у хакасов его встречаемость в несколько раз
выше, чем у европеоидов. Вторым по частоте
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 31, № 6, 2011
являлся генотип R3R4 IL-1Rа, доля которого
была наибольшей у хакасов, больных язвенной
болезнью (р < 0,05). Редкими генотипами у хакасов
были гомозиготы R3R3 и R2R2, а также
гетерозиготы R2R4 IL-1Ra (см. таблицу). У европеоидов,
страдающих язвенной болезнью и
хроническим гастритом, встречаемость R2R2
и R2R3 IL-1Ra была выше, чем в контроле и
в аналогичных группах хакасов (см. таблицу).
Следует отметить, что у европеоидов выявлена
ассоциативная взаимосвязь между генотипом
R2R3 IL-1Ra и риском развития язвенной болезни
(ОШ = 7,1, 95% ДИ 1,9–31,4).
IL-6, ключевой медиатор Th2-пути, относится
к цитокинам «первого уровня», которые
секретируются в ответ на антигенную стимуляцию
НР. IL-6 способствует переключению
синтеза IgM на IgG, являясь фактором дифференцировки
В-клеток. Распределение генотипов
–174 G>C IL-6 среди хакасов показало, что
наиболее частыми были гомозиготы GG –174
G>C (см. таблицу). Доля гетерозигот GС 174
G>C IL-6 у больных была ниже, чем в контро7
Стр.3